กิจกรรมแนะนำการแยกองค์ประกอบฟีนอลิกจากผนังน้ำหอมแอนเนสลี และผลต่อเซลล์ของพวกมันต่อความเครียดที่เกิดจากออกซิเดชันของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ในเซลล์ HepG2 ตอนที่ 2

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

2.7. ผลการยับยั้งการสร้าง ROS ภายในเซลล์

ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันเป็นความไม่สมดุลระหว่างการเกิดออกซิเดชันและสารต้านอนุมูลอิสระในร่างกาย [28] การสะสมของ ROS มากเกินไปอาจนำไปสู่ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันซึ่งอาจทำให้เซลล์และเนื้อเยื่อเสียหาย เช่น ไขมัน เยื่อหุ้มเซลล์ และดีเอ็นเอ [29] สารต้านอนุมูลอิสระรวมทั้งโพลีฟีนอลและฟลาโวนอยด์สามารถช่วยให้ร่างกายลดความเสียหายที่เกิดจาก ROS เหล่านี้ได้ โดยทั่วไป H, O ถูกใช้อย่างกว้างขวางเพื่อกระตุ้นการผลิตที่ผิดปกติของ ROS ภายในเซลล์ และทำให้การป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระของเซลล์บกพร่อง [30] ในการศึกษาปัจจุบันของเรา H2O2 ได้รับเลือกให้กระตุ้นการสะสมของ ROS ภายในเซลล์ที่ผิดปกติและทำให้การป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระของเซลล์บกพร่อง เพื่อประเมินผลการยับยั้งการสร้าง ROS ภายในเซลล์ใน H, O2-เซลล์ HepG2 ที่เหนี่ยวนำโดย O2- ระดับของ ROS ภายในเซลล์ได้รับการทดสอบโดยโฟลว์ไซโตเมทรี โดยย่อ เซลล์ HepG2 ถูกเพาะเลี้ยงในจาน 6-หลุม(เซลล์ 1 × 10 องศา/หลุม) หลังจากการบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงของสารสกัดที่แตกต่างกัน 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร หรือ Vc 8 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (กลุ่มที่เป็นบวก) กลุ่มทั้งหมดยกเว้นกลุ่มควบคุมถูกเหนี่ยวนำโดย H O เป็นเวลา 6 ชั่วโมง ระดับ ROS ภายในเซลล์ของสารประกอบแต่ละชนิดถูกทดสอบ (รูปที่ 3) อัตราส่วนการสร้าง ROS เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเป็น 215.64 ± 9.80 เปอร์เซ็นต์ใน H2O ซึ่งเป็นกลุ่มที่ได้รับการบำบัดเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (100 เปอร์เซ็นต์) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่บำบัดด้วย H, O สารประกอบ 2,5 และ 6 ที่ยับยั้งการผลิต ROS ภายในเซลล์อย่างน่าทึ่ง (p<0.05), and="" their="" inhibitory="" effect="" was="" equal="" to="" the="" vc="" group="" (figure="" 3).="" many="" phenolics="" have="" been="" proven="" to="" have="" a="" protective="" effect="" against="" intracellular="" ros="" by="" h2o2="" induction[31].="" additionally,="" compound="" 6="" displayed="" the="" strongest="" suppressive="" effect="" on="" intracellular="" ros="" production,="" which="" suggests="" that="" flavonoid="" compounds="" play="" a="" crucial="" role="" in="" inhibiting="" intracellular="" ros="">

2.8. Cytoprotective Effect ต่อ H2O2-กระตุ้นการตายของเซลล์

อะพอพโทซิสเป็นปรากฏการณ์ทางชีววิทยาพื้นฐานของเซลล์ ซึ่งมีบทบาทสำคัญในกลไกการควบคุมการเพิ่มจำนวน การเติบโต และการกลายพันธุ์ของเซลล์ และความเสถียรของสภาพแวดล้อมภายใน อะพอพโทซิสซึ่งแตกต่างจากเนื้อร้ายคือการตายของเซลล์ชนิดพิเศษ ความผิดปกติของกระบวนการ apoptotic ส่งผลเสียต่อร่างกายและเป็นสาเหตุของโรคต่างๆ [32] H2O2 เป็นโมเลกุลส่งสัญญาณที่สำคัญ ควบคุมกระบวนการของการเพิ่มจำนวน การเจริญเติบโต และการตายของเซลล์ [5] การศึกษานี้วัดการตายของเซลล์ HepG2 ที่เหนี่ยวนำโดย H, O และประเมินผลการยับยั้งเซลล์ของสารประกอบ 2, 5 และ 6 หลังจากบำบัดเซลล์ HepG2 ด้วย 1.0 mM H2O2 อัตราส่วนการตายของเซลล์จะเพิ่มขึ้นอย่างน่าทึ่ง ( 57.20±1.97 เปอร์เซ็นต์ ) เทียบกับกลุ่มควบคุม (9.10±0.62 เปอร์เซ็นต์ ,p<0.05)(figure 4).="" the="" ratios="" of="" apoptotic="" cells="" in="" the="" treated="" groups="" of="" compounds="" 2,="" 5,="" and="" 6="" significantly="" decreased="" compared="" with="" the="" h2o2-treated="" group="" (model="" group,=""><0.05)(figure 4).="" moreover,="" compound="" 6="" had="" significant="" efficiency="" in="" protecting="" hepa-2="" cells="" from="" h2o2="" toxicity,="" and="" the="" cell="" apoptosis="" ratio="" of="" 6(10.56±1.15%)was="" lower="" than="" that="" of="" the="" vc="" group="" (positive="" control),="" which="" was="" equal="" to="" that="" of="" the="" control="" group(figure="" 4).="" meanwhile,="" compounds="" 2="" and="" 5="" showed="" a="" moderate="" cytoprotective="" effect="" with="" cell="" apoptosis="" ratios="" of="" 2(26.76±2.60%)="" and="" 5(27.64±0.83%).="" the="" differences="" in="" antioxidant="" capacity="" may="" be="" attributed="" to="" the="" number="" of="" phenolic="" hydroxyl="" moieties="" and="" the="" link="">

3. วัสดุและวิธีการ

3.1. เคมีภัณฑ์และรีเอเจนต์

เมธานอล อะซีโตไนไตรล์ และกรดฟอร์มิกสำหรับโครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง (HPLC) เป็นเกรด HPLC และซื้อจากเมอร์ค (ดาร์มสตัดท์ เยอรมนี) ตัวทำละลายสำหรับการสกัดตัวอย่าง ได้แก่ เอทานอล ไดคลอโรมีเทน และเอ็น-บิวทานอล อยู่ในระดับวิเคราะห์ น้ำปราศจากไอออนถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ระบบน้ำบริสุทธิ์พิเศษของ Milli-Q (Millipore, Bedford, Massachusetts, MA, USA) และใช้ในการทดลองทั้งหมด ซื้อสารประกอบมาตรฐานฟีนอลิกของกรดแกลลิก รูติน โทรลอกซ์ และวิตามินซีจาก Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (เฉิงตู ประเทศจีน) เมทิลไทอะซอล-2-อิล-25-ไดฟีนิล เททราโซเลียม โบรไมด์ (MTT), สารทำปฏิกิริยาโฟลิน-ซิโอคาลเตอ, 2,2'-และ-บิส(3-เอทิลเบนซีน-ไทอะโซลีน-6-กรดซัลโฟนิก)( ABTS),2,2-ไดฟีนิล-1-พิคริลไฮดราซิลเรดิคัล (DPPH), 1,3,5-ไตร(2-ไพริดิล)-2,4,{{23 }}triazine (TPTZ),2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) และ FeSO4-7ซื้อจาก Sigma-Aldrich (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) สเปกตรัม NMR ได้มาจากการใช้ Bruker AV-400 และ/หรือ DRX-500 สเปกโตรมิเตอร์ สเปกตรัม ESIMS ถูกบันทึกบนสเปกโตรมิเตอร์ An Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

3.2. การเตรียมตัวอย่าง

น้ำหอม Anneslea Wall. เก็บใบจากเมือง Lincang ของจีนในวันที่ 2 กรกฎาคม020 ใบไม้ถูกทำให้แห้งในห้องที่มีร่มเงาจนน้ำหนักคงที่แล้วจึงนำมาบดเป็นผงด้วยเครื่องบดไฟฟ้า การสกัดและการแยกส่วนดำเนินการตามวิธีการที่เรารายงานไว้ก่อนหน้านี้โดยมีการดัดแปลงเล็กน้อย [33] ตัวอย่างที่เป็นผง (100 กรัม) ถูกผสมกับตัวทำละลายเอทานอลที่เป็นน้ำ 80 เปอร์เซ็นต์ 1000 มล. และอัลตราโซนิกในอ่างทำความสะอาดอัลตราโซนิกที่ 200 วัตต์สามครั้ง (0.5 ชม. ต่อครั้ง) จากนั้น สารละลายโซนิคถูกรวบรวมและหมุนเหวี่ยงที่ 1500×g เป็นเวลา 10 นาทีโดยเครื่องหมุนเหวี่ยง Eppendorf (TGL-20B, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, Shanghai, China) ส่วนลอยเหนือตะกอนที่รวมกันถูกทำให้เข้มข้นที่ 50 องศาโดยเครื่องระเหยแบบหมุน (Hei-VAP, ไฮดอล์ฟ, เยอรมนี) และถูกทำให้แห้งเพิ่มเติมโดยเครื่องทำแห้งแห้งแบบสุญญากาศ (Alpha 1-2 LD plus, Christ, Germany) สารสกัดเอธานอลแบบหยาบ (CE, 30 ก.) ถูกแขวนลอยใหม่ด้วยน้ำและแบ่งส่วนอย่างเป็นลำดับด้วยตัวทำละลายไดคลอโรมีเทน เอทิล อะซิเตต และเอ็น-บิวทานอลสามครั้ง หลังจากการทำให้เข้มข้นและการทำให้เยือกแข็ง ได้ส่วนของไดคลอโรมีเทน (DF), เศษส่วนเอทิลอะซิเตต (EAF), เศษส่วนของเอ็น-บิวทานอล (BF) และเศษส่วนของน้ำที่เหลือ (RWF) ที่มีน้ำหนัก 3.2 ก.,6.3 ก.,7.2 ก. และ 8.2 ก. ตามลำดับ ตามกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระของเศษส่วนที่แตกต่างกัน BF ถูกโครมาโตกราฟีบนเสาแก้ว (30 มม. × 400 มม.) ที่บรรจุเปียกด้วยเรซินไฮเดรต D101 ที่เลือกไว้ 20 กรัม (เรซินแห้ง) ปริมาตรเบด (BV) ของเรซินคือประมาณ 40 มล. หลังจากถึงจุดอิ่มตัวที่ดูดซับแล้ว คอลัมน์แรกจะถูกล้างด้วยน้ำกลั่นด้วย 4×BV แล้วชะด้วยเอธานอล-น้ำ (0:100,20:80,50:50,80:20,100:0,v/y, อันละ4× BV) เพื่อให้ได้เศษส่วนห้าส่วน (BF-A ถึง E) แต่ละส่วนของสารละลายดีดูดซับถูกทำให้เข้มข้นจนแห้งภายใต้สุญญากาศ CE, เศษส่วนสี่ส่วน (DF, EAF, BF และ RWF) และเศษย่อยห้าส่วน (BF-A ถึง E) ถูกเก็บไว้ในตู้เย็น (-20 องศา ) สำหรับการทดลองเพิ่มเติม

3.3. การแยกองค์ประกอบที่ใช้งานอยู่โดยคำแนะนำทางชีวภาพ

ภายใต้การแนะนำของการสอบวิเคราะห์สารต้านอนุมูลอิสระและการวิเคราะห์ HPLC ส่วนของสารต้านอนุมูลอิสระถูกโครมาโตกราฟีเพิ่มเติมสำหรับการแยกสารประกอบบริสุทธิ์ โดยสังเขป BF ถูกนำไปยังคอลัมน์ไฮเดรตเรซิน D101 เพื่อให้เกิดเศษย่อยห้าส่วน(BF-A ถึง E) BF-C(1.5g) ถูกนำไปยังคอลัมน์ซิลิกาเจล, ที่ชะด้วย DCM/MeOH(15:1), และจากนั้นถูกแยกออกโดยใช้การเตรียม TLC(DCM/MeOH, 10:1) เพื่อให้ได้สารประกอบ 6 (118 มก. ) และ 7(10 มก.) BF-D(1.1 กรัม) ถูกนำไปยังคอลัมน์ซิลิกาเจล(CHCl3/MeOH 10:1, 5:1) เพื่อให้สารประกอบ 1(129 มก.)และ 4(15 มก.)BF-E(1.2 กรัม)ถูกนำไป คอลัมน์ซิลิกาเจล (CHCl3/MeOH, 30:1, 10:1, 5:1) เพื่อให้ได้สารประกอบ 1(216 มก.),2(135 มก.) และของผสม ส่วนหลังถูกทำให้บริสุทธิ์โดยคอลัมน์ซิลิกาเจล (CHCl3/MeOH ,12:1)เพื่อให้ได้สารประกอบ 3 (19 มก.) และ 5(15 มก.) (รูปที่ 5)

3.4.การอธิบายโครงสร้างของสารประกอบ 1-7

ตามกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของเศษส่วนต่างๆ เศษส่วนสามส่วน BF-C ถึง E ถูกส่งไปยังคอลัมน์โครมาโตกราฟี ด้วยวิธีนี้ การแยกส่วนทางชีวภาพของ BF-C ถึง E นำไปสู่การแยกสารประกอบฟีนอลิกเดี่ยวเจ็ดชนิด โครงสร้างของพวกมันถูกระบุว่าเป็นคอนฟูโซไซด์(1)[34], วัคซินิโฟลิน (2)[34],1-[4-( -D-glucopyranosyloxy)-2-ไฮดรอกซีฟีนิล]-3- (4-ไฮดรอกซี-3-เมทอกซีฟีนิล)-1-โพรพาโนน (3) [35], (S)-นารินจินิน-7-O- -ดี-กลูโคปาราโนไซด์ (4)[ 22],2',3,4,4'-tetrahydroxydihydrochalcone(5)[26], (epi)-catechin (6)[26] และ cornoside (7)[36](รูปที่ 1B) โดยการวิเคราะห์ 1D ข้อมูล -NMR และ ESI-MS และการเปรียบเทียบกับสารประกอบที่รายงานก่อนหน้านี้ในวรรณคดี ในหมู่พวกเขา สารประกอบ 3,4 และ 7 ถูกแยกออกจากพืชนี้เป็นครั้งแรก

Cistanche สามารถปรับปรุงภูมิคุ้มกัน

คอนฟูโซไซด์ (1). สูตรโมเลกุลถูกกำหนดเป็น C21H24O และการแยกให้เข็มสีเหลืองซีด 129 มก. ข้อมูล 'IH NMR (500 MHz, DMSO-d6) และ ESI-MS(m/z 421 [M บวก H]) เหมือนกันทุกประการกับสารประกอบที่รายงานก่อนหน้านี้ในวรรณกรรม [34] การระบุยังได้รับการสนับสนุนเพิ่มเติมโดย 13C NMR（125 MHz,DMSO-dg）∶δ204.4 （s,C=O),163.5(s,C-2'),163.3(s,C -4'),155.5(s,C-4),132.6(d,C-6'),130.9(s,C-1),129.2(d,C -2, 6),115.0(d,C-3/C-5),114.4(s, C-1'),108.3(d, C{{45} }'),103.4(d,C-1"),99.6(d,C-3'),77.1(d, C-5"),76.4(d, C{{ 57}}"),73.1(d,C-2"),69.5(d, C4'),60.5(t,C-6'),39.8(t,C- ),28.9( เสื้อ ค-6).

ได้รับวัคซินีไอโฟลิน (2) เป็นผงอสัณฐานสีเหลือง (153 มก.) และกำหนดสูตรโมเลกุลของ C2H24O1o.'H NMR(500 MHz, DMSO-dg) และ ESI-MS (m/z 437 [M บวก H])ข้อมูลเหมือนกับข้อมูลที่รายงานก่อนหน้านี้ [34] การระบุนี้ได้รับการสนับสนุนเพิ่มเติมโดย 13CNMR（125 MHz,DMSO-de）∶δ204.4 （s, C=O）,163.5（s, C-2'）,163.3 (s, C{ {21}}),145.0(s, C-3),143.3(s, C-4),132.6(d, C-6),131.7(s, C{{33) }}),118.9(d, C-6),115.8(d, C-2),115.4(d, C-5),114.4(s, C-1 '), 108.3(d, C-5'),103.4(d, C-1'),99.6(d,C-3'),77.1(d, C{{57) }}"),76.4(d,C-3'),73.1(d,C-2"),69.5(d,C-4'),60.5(t,C{ {69}}'),39.4(t,Ca),29.1(t, C-6)

{{0}}[4-( -D-Glucopyranosyloxy)-2-ไฮดรอกซีฟีนิล]-3-(4-ไฮดรอกซี-3-เมทอกซีฟีนิล){{8 }}โพรพาโนน (3). ได้รับสารประกอบในรูปเข็มไร้สี(19มก.) และสูตรโมเลกุลถูกกำหนดเป็น C22H2O10.'H NMR(400 MHz, DMSO-d6) และ ESI-MS (m/z451 [M บวก H]* ) ข้อมูลที่เห็นด้วยกับวรรณกรรม [35] การระบุตัวตนได้รับการสนับสนุนเพิ่มเติมโดย 13CNMR（100 MHz,DMSO-d）∶δ204.5（s,C=O）,163.5（s,C-2'),163.3（s,C{ {31}}'),147.4(s,C-3),144.6(s,C-4),132.6(d,C-6),131.6(s,C{{ 43}}),120.4(d,C-6),115.2 (d, C-5),114.5(s,C-1'), 112.6(d,C{{55) }}),108.3(d,C-5'), 103.3 (d,C-1"),99.5 (d, C-3'),77.0(d,C{{ 67}}'),76.3(d, C-3"), 73.0(d,C-2"),69.5(d,C-4'),60.5(t,C -6'),55.5(q,C-OCH3),39.5(t, C- ),29.4(t,C-6)

(S)-Naringenin-7-O- -D-glucopyranoside (4) มีสูตรโมเลกุลของ C21H2.O10 ซึ่งได้รับเป็นผงสีขาว 15 มก. ข้อมูล IH NMR (500 MHz, DMSO-dg)และ ESI-MS (m/z 435 [M บวก H] plus ) สอดคล้องกับงานก่อนหน้านี้[22] การระบุยังได้รับการสนับสนุนเพิ่มเติมโดย13C NMR（125 MHz,DMSO-d）∶δ197.2 （s, C-4）,165.3（s, C-7),165.2 (s, C{{25 }}), 162.9(s, C-9), 157.9(s, C-4'),128.6(s, C-1'), 128.4(d, C{{37) }}',6'),115.2 (d, C-3'/C-5'),1{{110}}3.2 (s,C-10 ),99.6(d,C-1'),96.5(d,C-6),95.4(d,C-8),78.7(d,C-2) ,77.0(d, C{{6{{240}}}"),76.3 (d,C-3'),73.0(d,C{{ 66}}"), 69.5 (d,C-4'),60.5(t,C-6'),42.0(t,C-3) 2'3,4,A'-Tetrahydroxydihydrochalcone (5) มีสูตรโมเลกุลเป็น C15H4O5 และแยกออกมา (15 มก.) เป็นผงสีขาว'H NMR(400 MHz, DMSO-dg)และ ESI-MS (m/z 275 [ ข้อมูล M บวก H] บวก ) สอดคล้องกับข้อมูลที่รายงานในวรรณคดี [26] การระบุยังได้รับการสนับสนุนเพิ่มเติมโดย 13C NMR（125 MHz, DMSO-d6)∶δ203.9 （s, C=O）,164.7(s,C-2'),164.2(s,C -4'),144.9(s, C-3),143.3(s, C-4),133.0(d,C-6),131.8(s,C{ {114}}),118.9 (d,C-6),115.7(d,C-2),115.4(d,C-5),112.5 (s,C{{126) }}),108.2(d,C-5'),102.4(d,C-3'),39.5(t, C-a2),29.2(t, CB). (Epi)-คาเทชิน(6) ถูกแยกออกมาเป็นผงสีขาว(118 มก.)และสร้างสูตรโมเลกุลเป็น CHO4.1H NMR (400 MHz, DMSO-dg) และ ESI-MS (m/z 291 [M บวก H] บวก )data ตกลงได้ดีกับรายงานในวรรณคดี [26] การระบุยังได้รับการสนับสนุนเพิ่มเติมโดย13C NMR （125 MHz,DMSO-d6)∶δ156.4（s,C-7）,156.1（s, C-5),155.3（s,C{{162 }}）,144.8(s,C-3'),144.8(s,C-4'),130.5(s,C-1'),118.4(d,C{{ 174}}'),115.0(d,C-5'),114.4(d,C-2'), 99.0(s,C-10),95.1(d,C{ {186}}),93.8(d, C-8),80.9(d, C-2),66.2 (d,C-3),27.8(t, C{{198 }}) ได้รับคอร์โนไซด์ (7) เป็นของแข็งอสัณฐาน (10 มก.) และหาสูตรโมเลกุลเป็น C1H20O8.'H NMR (500 MHz,DMSO-dg) และ ESI-MS (m/z317 [M บวก H] บวก ) ข้อมูลที่สอดคล้องกับ ข้อมูลที่เผยแพร่ [36] การระบุนี้ได้รับการสนับสนุนเพิ่มเติมโดย 13CNMR（100 MHz,DMSO-dg）∶δ185.3（s, C-4）,153.3（d,C-2),153.2 （d,C{{220 }}),126.4(d, C-3),126.4(d,C-5),102.8(d,C-1'),76.8(d,C{{232} }'),76.6(d,C-3'),73.3(d,C-2'),70.0(d,C-4),67.3(s, C{{244} }}), 63.8(t, C-8), 61.0(t, C-6'), 39.7(t, C-7)

3.5. การหาปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด (TPC) และปริมาณฟลาโวนอยด์ทั้งหมด (TFC)

TPC และ TFC ของเศษส่วนสี่ส่วน (DF, EAE, BF และ RWF) และเศษส่วนห้าส่วน (BF-A ถึง E) ถูกวัดตามวิธีการที่เรารายงานไว้ก่อนหน้านี้ [37] สำหรับ TFC 1.0 มล. ของแต่ละตัวอย่าง (ที่มีความเข้มข้นที่ 1.0 มก./มล.) ที่ละลายในเมทานอลถูกผสมกับ 0.5 มล. ของสารทำปฏิกิริยา Folin-Ciocalteu ใน หลอดหมุนเหวี่ยงและฟักเป็นเวลา 1 นาที จากนั้น สารละลาย Na2CO3 เปอร์เซ็นต์ 20 เปอร์เซ็นต์ (โมลาร์)(1.5 มล.) และน้ำปราศจากไอออน (7.0 มล.) ถูกเติมลงในหลอดและเก็บไว้ที่ 70 องศาในอ่างน้ำเป็นเวลา 10 นาที หลังจากถูกทำให้เย็นลงจนถึงอุณหภูมิห้อง สารละลาย 200 uL ถูกถ่ายโอนไปยังไมโครเพลท 96-หลุม และการดูดกลืนแสงถูกกำหนดหาที่ 765 นาโนเมตรโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)

สำหรับ TFC 1.2 มล. ของสารละลายตัวอย่าง (ที่มีความเข้มข้นที่ 1.0มก./มล.) ถูกผสมกับ 0.3 มล. ของ NaNO (5 เปอร์เซ็นต์ m/o) และ 3.8 มล. จาก 7 0 เปอร์เซ็นต์ที่เป็นน้ำเอทานอลและบ่มเป็นเวลา 8 นาที ต่อจากนั้น 0.3 มล. 10 เปอร์เซ็นต์ที่เป็นน้ำ Al(NO3),4 มล.4 เปอร์เซ็นต์ที่เป็นน้ำของ NaOH และ 0.4 มล. เอทานอลที่เป็นน้ำ 70 เปอร์เซ็นต์ถูกเติมลงในของผสม และปล่อยให้ทำปฏิกิริยาที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที จากนั้น 200 ไมโครลิตรของสารละลายถูกถ่ายโอนไปยังไมโครเพลท 96-หลุม ซึ่งวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 510 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท TFC และ TPC แสดงเป็นมิลลิกรัมเทียบเท่ากรดแกลลิก (mg GAE/gextract) และเทียบเท่ารูตินต่อกรัมของสารสกัด (mg RE/g extract)

3.6.การกำหนดฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ

ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของเศษส่วนสี่ส่วน (DF, EAF, BF และ RWF) และเศษส่วนห้าส่วน (BF-A ถึง E) ได้รับการประเมินด้วยการผสมผสานระหว่างการทดสอบ DPPH และ ABTS และการทดสอบ FRAP ตามวิธีการที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้านี้ [33]. สำหรับการสอบวิเคราะห์ DPPH 50μL ของสารละลายตัวอย่าง （50,100,200ug/mL) ถูกผสมกับสารละลาย DPPH 0.2 มิลลิลิตร (0.1 มิลลิโมล/ L) ในจานหลุม 96- และปล่อยให้ฟักเป็นเวลา 30 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 517 นาโนเมตรด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) สำหรับ ABTS สารละลายตัวอย่าง 25 ไมโครลิตร (50, 100, 200 ug/mL) ถูกเติมลงในสารละลาย LABTS 0.2 มล. (7 มิลลิโมล) /ลิตร) ของผสมถูกเก็บไว้ในที่มืดเป็นเวลา 6 นาที และจากนั้น การดูดกลืนแสงถูกบันทึกที่ 734 นาโนเมตร สำหรับ FRAP สารละลายตัวอย่าง 20 ไมโครลิตร (50,100,200ug/mL) ถูกผสมกับรีเอเจนต์ FRAP 0.18 มล. (7 มิลลิโมล/ L) หลังจากฟักเป็นเวลา 10 นาทีในความมืดที่ 37 องศา หาค่าการดูดกลืนแสงที่ 593 นาโนเมตร การทดสอบทั้งหมดดำเนินการเป็น 3 เท่า ผลลัพธ์ของค่า DPPH, ABTS และ FRAP แสดงเป็น umol Trolox เทียบเท่าต่อกรัมของ สารสกัด (μmol TE/g สารสกัด).

3.7.การวิเคราะห์ HPLC

BF และสารประกอบ {{0}} ถูกวิเคราะห์บนระบบ Agilent 1260 HPLC ที่ควบคู่กับตัวตรวจจับอาร์เรย์ไดโอด ก่อนการวิเคราะห์ สารละลายตัวอย่างที่เตรียมใหม่ถูกกรองผ่านเมมเบรนไนลอน 0.45 ไมโครเมตร การแยกสารดำเนินการโดยใช้คอลัมน์ Reprosil-Pur Basic C18 (5 μm, 4.6×250 mm, Germany) ที่ระดับ 35 องศา ปริมาตรการฉีดคือ 5.0 ไมโครลิตร อัตราการไหล 1.0 มล./นาที และความยาวคลื่นการตรวจจับถูกตั้งค่าที่ 280 นาโนเมตร เฟสเคลื่อนที่ถูกทำให้เป็นกรดในน้ำที่มีกรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์ (เฟส A) และอะซีโตไนไตรล์ (เฟส B) การชะเกรเดียนท์เชิงเส้นถูกดำเนินการดังนี้:0-3 นาที, 20 เปอร์เซ็นต์ B;3-10 นาที, 40 เปอร์เซ็นต์ B;10-15 นาที 60 เปอร์เซ็นต์ B;15-20 นาที 100 เปอร์เซ็นต์ B.

3.8. การเพาะเลี้ยงเซลล์และความมีชีวิตของเซลล์

ซื้อเซลล์มะเร็งตับ HepG2 จาก Kunming Cell Bank (คุนหมิง ประเทศจีน) เซลล์ HepG2 ถูกปลูกใน DME เสริมด้วยเพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์และซีรั่มวัวในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ในบรรยากาศของ CO 5 เปอร์เซ็นต์ / อากาศ 95 เปอร์เซ็นต์ที่ 37 องศา เมื่อเซลล์ถูกบ่มให้มีความหนาแน่นที่เหมาะสม (ประมาณ 80 เปอร์เซ็นต์) พวกมันถูกบำบัดด้วยกลุ่มควบคุมเชิงบวก (Vc) และสารประกอบที่ถูกแยกเดี่ยวสำหรับการทดลองเพิ่มเติม

ความมีชีวิตของเซลล์ถูกกำหนดโดยการทดสอบ MTT สำหรับการประเมินความเป็นพิษต่อเซลล์ของแต่ละตัวอย่าง [29] เซลล์ที่ความหนาแน่น 1×104 เซลล์ต่อหลุมถูกเพาะในจาน 96-หลุม และปล่อยให้ฟักตัวเป็นเวลา 24 ชั่วโมง สารประกอบแต่ละชนิด (เตรียมเป็นสี่ขนาดตั้งแต่ 50 ถึง 200 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร） ถูกเติมในแต่ละหลุมเป็นเวลา 20 ชั่วโมง จากนั้น เซลล์ถูกบำบัดโดยใช้สารละลาย MTT ที่มีความเข้มข้นสุดท้าย 4 ชั่วโมง ตัวกลางที่มี MTT ถูกกำจัดออก และ 200 ไมโครเพลทรีดเดอร์รีดเดอร์ไมโครเพลทบันทึกค่าการดูดกลืนแสงที่ 570 นาโนเมตร ผลการศึกษาพบว่าสารประกอบแต่ละชนิดไม่เป็นพิษต่อเซลล์ HepG2 ที่ความเข้มข้นที่ทดสอบ

3.9.การยับยั้งการสร้าง ROS ใน H2O2-เซลล์ HepG2 ที่เหนี่ยวนำ

เซลล์ HepG2 ที่เหนี่ยวนำโดย H,O ถูกใช้เพื่อกำหนดหาผลการยับยั้งต่อการผลิต ROS [3] เซลล์ HepG2 (1.0×10 องศาต่อหลุม) ถูกเพาะในจาน 6-หลุม และเพาะเลี้ยงร่วมกับสารประกอบที่แยกได้ที่มี 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรและ Vc（8 ไมโครกรัม/ มล.). หลังจากการฟักไข่เป็นเวลา 20 ชั่วโมง ตัวกลางจะถูกลบออก และ 2 ไมโครลิตรของ H, O,(0.5 mM) ถูกเติมในแต่ละหลุมเป็นเวลาอีก 6 ชั่วโมง ที่ส่วนท้ายของการทดลอง เซลล์ถูกติดฉลากด้วย DCFH-DA(10 มิลลิโมลาร์) 2 ไมโครลิตร (10 มิลลิโมลาร์) ในความมืดที่ 37 องศา เป็นเวลา 20 นาที การดูดกลืนแสงถูกบันทึกโดยโฟลว์ไซโตเมทรี (Guava easy yet 6-2L, Millipore, Billerica, Massachusetts, MA, USA)

3.10.การกำหนดการตายของเซลล์อะพอพโทซิส

ผลการป้องกันของสารประกอบแต่ละชนิดต่ออะพอพโทซิสที่เหนี่ยวนำโดย H2O2-ของเซลล์ HepG2 ถูกกำหนดหาโดยใช้ชุดอะพอพโทซิส VFITC/PI ของแอนเนกซินของมนุษย์ [38] เซลล์ HepG2 ถูกบำบัดล่วงหน้าโดยมีหรือไม่มีสารประกอบที่แยกได้เป็นเวลา 48 ชั่วโมง หลังจากการฟักไข่ 100 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์การจับถูกเพิ่มไปยังเซลล์ และเซลล์ทำปฏิกิริยาในความมืดด้วยสารเติมแต่ง V-FITC 10 ไมโครลิตร เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้องและด้วยโพรพิเดียม ไอโอไดด์ (PI) 10 ไมโครลิตรในอ่างน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที นาทีตามลำดับ เซลล์อะพอพโทซิสถูกวิเคราะห์ทันทีโดยใช้โฟลว์ไซโตเมทรี

3.11.การวิเคราะห์ทางสถิติ

การทดลองทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่า ค่าทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) วิเคราะห์ความแตกต่างภายในและระหว่างกลุ่มโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) ตามด้วยการทดสอบของทูคีย์ ความแตกต่างถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติที่ p<0.05. all="" analyses="" were="" performed="" using="" origin="" 2019b="" software="" (originlab,="" northampton,="" ma,="">

4. บทสรุป

ในการศึกษานี้ แยกเศษส่วนต่าง ๆ จากใบ A.fragrans และวิเคราะห์ TPC และ TFC ภายใต้การนำการออกฤทธิ์ของสารต้านอนุมูลอิสระแยกออก สารประกอบ 1-7 ซึ่งรวมถึงฟลาโวนอยด์ไกลโคไซด์สี่ชนิด (1-4) และฟลาโวนอยด์สองชนิด (5 และ 6) ถูกแยกออกและระบุได้จากใบก. ในสารประกอบฟลาโวนอยด์ สารประกอบ 2, 5 และ 6 แสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่มีนัยสำคัญใน DPPH, ABTS การกำจัดอนุมูลอิสระและการสอบวิเคราะห์ FRAP นอกจากนี้ ยังป้องกันความเสียหายจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันอย่างเห็นได้ชัดผ่านการลดลงของปริมาณ ROS และการตายของเซลล์ในเซลล์ HepG2 ที่เหนี่ยวนำโดย H2O2- จากผลการวิจัยเหล่านี้ สารประกอบโพลีฟีนอล โดยเฉพาะอย่างยิ่งฟลาโวนอยด์ มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระมากเนื่องจากกลุ่มฟีนอลไฮดรอกซิล นอกจากนี้ สารประกอบ 2 ซึ่งมีไกลโคไซด์มอยอิตีและหมู่ฟีนอลิกไฮดรอกซิล 3 หมู่ เป็นส่วนประกอบสารต้านอนุมูลอิสระหลักที่มีเนื้อหาสูงสุดจากใบก. สารประกอบ 6 แสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่ดีที่สุด ซึ่งอาจมีส่วนสำคัญต่อการออกฤทธิ์ของ A.fragrans นอกจากนี้ สารสกัดจาก A.fragrans ยังเป็นแหล่งของสารต้านอนุมูลอิสระตามธรรมชาติในเครื่องดื่มเพื่อสุขภาพ การศึกษาสารประกอบจากใบ A. fragrans ชี้ให้เห็นว่าสิ่งเหล่านี้สามารถใช้เป็นชาเพื่อสุขภาพที่มีสารต้านอนุมูลอิสระในการรักษาความเสียหายของเซลล์ที่เกิดจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และสามารถทำหน้าที่เป็นอาหารเสริมที่ใช้ในอุตสาหกรรมอาหารและสุขภาพ

บทความนี้คัดมาจาก Molecules 2021, 26, 3690 https://doi.org/10.3390/molecules26123690 https://www.mdpi.com/journal/molecules