การกลายพันธุ์ของ Homozygous KLHL3 ที่เป็นนวนิยายซึ่งเป็นสาเหตุของการเกิด Pseudohypoaldosteronism แบบถอยแบบ Autosomal Type II ที่ได้รับการวินิจฉัยในช่วงปลายชีวิต
Nov 02, 2023
บทนำบทคัดย่อ:
Pseudohypoaldosteronism type II (PHA II) เป็นโรค Mendelian ซึ่งมีภาวะกรดในเลือดสูงและมีระดับ renin ในพลาสมาต่ำ ซึ่งมักเกี่ยวข้องกับความดันโลหิตสูง การกลายพันธุ์ใน WNK1, WNK4, CUL3 และ KLHL3 ทำให้เกิด PHA II โดยมีการกลายพันธุ์ที่โดดเด่นใน WNK1, WNK4 และ CUL3 และการกลายพันธุ์ที่โดดเด่นหรือด้อยใน KLHL3 มีรายงาน 14 ครอบครัวที่มีการกลายพันธุ์แบบด้อยของ KLHL3 โดยมีการวินิจฉัยเมื่ออายุ 3 เดือนถึง 56 ปี โดยทั่วไปในบุคคลที่มีการทำงานของไตปกติ
วิธีการ: เราทำการตรวจสอบทางคลินิกและทางพันธุกรรมในผู้ป่วยที่มีความดันโลหิตสูงในเลือดสูง และใช้การจำลองพลวัตของโมเลกุล การแสดงออกที่แตกต่างกันในเซลล์ COS7 และ Western blotting เพื่อตรวจสอบผลของการกลายพันธุ์ของโรคที่ผู้สมัคร KLHL3 ต่อการแสดงออกของโปรตีน WNK4
คลิกที่นี่เพื่อรับสูตรสมุนไพรของ CISTANCHE สำหรับไต
ผลลัพธ์: ผู้ป่วย ซึ่งเป็นผู้หญิงอายุ 58- ปีจากครอบครัวที่เป็นโรคโลหิตจาง มีอาการความดันโลหิตสูง ภาวะเลือดเป็นกรดในเลือดสูงอย่างต่อเนื่อง ซึ่งสัมพันธ์กับอาการปวดกล้ามเนื้ออย่างรุนแรง โรคไตอักเสบ โรคไตเรื้อรัง (CKD) และโรคหลอดเลือดหัวใจ การบำบัดด้วยไฮโดรคลอโรไทอาไซด์แก้ไขภาวะโพแทสเซียมสูง ความดันโลหิตสูง และปวดกล้ามเนื้อ การวิเคราะห์ทางพันธุกรรมเผยให้เห็นการกลายพันธุ์ของ p.Arg431Trp แบบโฮโมไซกัสที่ตำแหน่ง KLHL3 ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูง การจำลองชี้ให้เห็นถึงความคงตัวของโปรตีนกลายพันธุ์ที่ลดลง ซึ่งได้รับการยืนยันโดย Western blot เมื่อเปรียบเทียบกับ KLHL3 ชนิดพันธุ์ป่า ทรานส์เฟกชันร่วมของ p.Arg- 431Trp KLHL3 ทำให้ระดับโปรตีน WNK4 เพิ่มขึ้น ซึ่งอนุมานได้ว่าทำให้เกิดการดูดซึมกลับของ NaCl เพิ่มขึ้นผ่านทางตัวพาที่ไวต่อไทอะไซด์และ PHA II
สรุป: แม้ในผู้ป่วยที่เสียชีวิตในช่วงบั้นปลายและมีอาการ CKD ควรสงสัยว่า PHA II หากระดับเรนินต่ำ และภาวะเลือดเป็นกรดในเลือดสูงและความดันโลหิตสูงไม่เพียงพอสำหรับระยะ CKD โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อมีประวัติครอบครัวที่น่าสงสัย
การแนะนำ
ภาวะความดันโลหิตสูงในหลอดเลือดแดงทั่วร่างกายส่งผลกระทบต่อผู้ใหญ่มากกว่า 1.1 พันล้านคนทั่วโลก [1] และถือเป็นปัจจัยเสี่ยงที่สำคัญที่สุดที่ปรับเปลี่ยนได้สำหรับการเจ็บป่วยและการเสียชีวิตจากทุกสาเหตุทั่วโลก [2] ประมาณ 90% ของผู้ป่วยที่เป็นผู้ใหญ่มีอาการที่เรียกว่าภาวะความดันโลหิตสูงปฐมภูมิหรือจำเป็นโดยมีสาเหตุจากยีนและสิ่งแวดล้อมหลายปัจจัย [2] ในขณะที่สาเหตุที่แท้จริงของความดันโลหิตสูงสามารถระบุได้ในส่วนที่เหลือ สาเหตุทั่วไปของความดันโลหิตสูงทุติยภูมิ ได้แก่ ภาวะอัลโดสเตอโรนในเลือดปฐมภูมิ ภาวะหยุดหายใจขณะหลับจากการอุดกั้น โรคไตวายเรื้อรัง และหลอดเลือดแดงไตตีบ [3] ในบางกรณีซึ่งพบไม่บ่อยนัก ความดันโลหิตสูงได้รับการถ่ายทอดทางพันธุกรรมเป็นลักษณะทางพันธุกรรมเดียว ผู้ป่วยที่ได้รับผลกระทบมักมีระดับเรนินในพลาสมาต่ำ ในขณะที่ระดับอัลโดสเตอโรนและอิเล็กโทรไลต์จะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับสาเหตุที่แท้จริง [4] ความดันโลหิตสูงรูปแบบ Mendelian มักปรากฏในวัยเด็กหรือวัยหนุ่มสาว ผู้ใหญ่มักไม่ค่อยได้รับการตรวจสอบความดันโลหิตสูงแบบ mono-genic; ดังนั้นจึงยังไม่ทราบความชุกของโรคในประชากรทั่วไป ในกลุ่มประชากรตามรุ่นที่เลือก (เกณฑ์การคัดเลือกอย่างน้อยหนึ่งรายการ: อายุที่เริ่มมีอาการน้อยกว่าหรือเท่ากับ 35 ปี ความดันโลหิตสูงที่ดื้อยา ความดันโลหิตสูงที่มีความผิดปกติของอิเล็กโทรไลต์ ความผิดปกติของฮอร์โมน ผลการถ่ายภาพที่ผิดปกติ หรืออาการทางคลินิกที่มีการชี้นำ) ยีนของผู้สมัคร 37 ตัวถูกคัดกรอง และตัวแปรที่ทำให้เกิดโรคหรือน่าจะเกิดโรคถูกระบุใน 33 รายจาก 1,179 ราย (2.8%) [5]
การศึกษานี้มุ่งเน้นไปที่ pseudohypoaldosteronism type II (PHA II) ซึ่งเป็นรูปแบบของความดันโลหิตสูง Mendelian ที่มีลักษณะเป็นกรดในเลือดสูงและระดับ renin ในพลาสมาต่ำ [6] PHA II เรียกอีกอย่างว่าความดันโลหิตสูงในเลือดสูงในครอบครัว มีการอธิบายครั้งแรกในปี พ.ศ. 2507 โดย Paver และ Pauline ในชายหนุ่มที่มีภาวะความดันโลหิตสูงและภาวะโพแทสเซียมสูงอย่างรุนแรงแม้จะมีการทำงานของไตเป็นปกติก็ตาม [7] ซึ่งมีลักษณะพิเศษเพิ่มเติมคือ Stokes และเพื่อนร่วมงาน [8] และ Arnold และ Healy [9] และแสดงให้เห็นว่ามีภาวะไตวายต่ำ พลาสมาเรนิน ตามรายงานของเด็กหญิงอายุ 10- ขวบที่มีรูปร่างเตี้ย ความดันโลหิตสูง ภาวะโพแทสเซียมสูงอย่างรุนแรง ภาวะเลือดเป็นกรดเล็กน้อย อัมพาตเป็นระยะ และเรนินที่ถูกกดขี่ในปี 1970 โดย Gordon และคณะ [10] กลุ่มอาการนี้บางครั้งเรียกว่ากลุ่มอาการกอร์ดอน
ในปี 2544 การกลายพันธุ์ในยีนไคเนสซีรีน-ทรีโอนีนไคเนสที่ไม่มีไลซีน (WNK) WNK1 และ WNK4 ถูกระบุว่าเป็นสาเหตุของ PHA II [11] และการกลายพันธุ์เพิ่มเติมใน KLHL3 (การเข้ารหัส kelch-like 3) และ CUL3 (การเข้ารหัส ยีน cullin 3) ถูกอธิบายไว้ในปี 2012 [12, 13] รูปแบบย่อยของ PHA II ที่เกิดจากการกลายพันธุ์ใน WNK1, WNK4 และ CUL3 เป็นความผิดปกติที่มีลักษณะเด่นของออโตโซม ในขณะที่การกลายพันธุ์ของ KLHL3 สามารถสืบทอดได้ทั้งในรูปแบบที่เด่นของออโตโซมหรือในรูปแบบที่ถอยของออโตโซม [12] KLHL3 มีโดเมน BTB ของเทอร์มินัล N ตามด้วยโดเมน BACK และโครงสร้างใบพัดหกใบของเทอร์มินัล C ซึ่งประกอบด้วยสิ่งที่เรียกว่าการทำซ้ำคล้ายเคลช์ (แสดงในรูปที่ 1d, 2a) การกลายพันธุ์ที่โดดเด่นของ KLHL3 จะกระจุกอยู่ในหรือระหว่างใบพัด ในขณะที่การกลายพันธุ์แบบถอยจะกระจายไปทั่วโปรตีน [12] กรณีถอยพบได้น้อยกว่ากรณีเด่น มีการเผยแพร่ผู้ป่วยทั้งหมด 21 รายจาก 14 ครอบครัวที่มีการกลายพันธุ์ของ KLHL3 แบบถอย [12–15] (ตารางที่ 1)
พยาธิสรีรวิทยาพื้นฐานของความดันโลหิตสูงใน PHA II จะเพิ่มการดูดซึม NaCl อีกครั้งผ่านทางพาหะที่ไวต่อไทอาไซด์ (Na-Cl cotransporter, NCCT) ในท่อที่ซับซ้อนส่วนปลายของไต และการรักษาด้วยไทอะไซด์จะแก้ไขทั้งความดันโลหิตสูงและความผิดปกติของอิเล็กโทรไลต์ในคนไข้ที่มี PHA II [16]. กล่าวโดยสรุป WNK1 และ WNK4 phosphorylate OSR1 (ยีนที่ตอบสนองต่อความเครียดออกซิเดชัน 1) และ SPAK (ไคเนสที่อุดมด้วยโพรลีนอะลานีนที่เกี่ยวข้องกับ Ste20-) ซึ่งต่อด้วยฟอสโฟรีเลทและกระตุ้น NCCT [17, 18] KLHL3 เป็นอะแดปเตอร์ซับสเตรตของ ubiquitin ligase CUL3; คอมเพล็กซ์ KLHL3-CUL3 ubiquitinylates ไคเนสของ WNK และส่งเสริมการย่อยสลายของพวกมัน [19] การสูญเสียการทำงานของ ubiquitin ligase หรือความบกพร่องในการจับกับ WNK kinase ทำให้เกิดความอุดมสมบูรณ์ของ WNK เพิ่มขึ้น เพิ่ม NCCT phosphorylation [18] และเพิ่มการดูดซึม NaCl ใน tubule ที่ซับซ้อนส่วนปลาย ในส่วนหลังของเนฟรอน การดูดซึม NaCl กลับคืนผ่านทาง ENaC (ช่องโซเดียมเยื่อบุผิว) และการหลั่ง K+ ผ่านทาง ROMK (ช่องโพแทสเซียมไขกระดูกด้านนอกของไต) จะลดลง [20, 21] หนูที่น่าพิศวงของ KLHL3 แสดงภาวะ hypoplasia ของ tubule ที่ซับซ้อนส่วนปลาย เพิ่มระดับ WNK1 และ WNK4 อย่างมาก และเพิ่ม OSR1, SPAK และ NCC phosphorylation ในไต นอกจากนี้ยังแสดงภาวะโพแทสเซียมสูง, ภาวะคลอเรสเตอรอลในเลือดสูงและภาวะกรดจากการเผาผลาญ [22] ที่นี่ เรารายงานผู้ป่วยที่มี PHA II แบบ autosomal-recessive และระบุลักษณะการกลายพันธุ์ทางพันธุกรรมและพยาธิสรีรวิทยา
วัสดุและวิธีการ
การเตรียมดีเอ็นเอและลำดับแซงเจอร์ DNA ถูกเตรียมจากตัวอย่างเลือดจากหลอดเลือดดำส่วนปลายโดยใช้ชุด QIAamp DNA Blood Maxi (Qiagen) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต PCR มาตรฐานและการจัดลำดับ Sanger แบบสองทิศทางโดยตรงของ DNA จีโนมดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์ที่เผยแพร่สำหรับ KLHL3 [13], WNK1 และ WNK4 [11] และ CUL 3_9 F (5′-AGGAGAACACTTTCTCAAACCG -3 ′) และไพรเมอร์ CUL 3_9 R (5′-TGTTCTTCTCCAAAACAATCTACC -3′) สำหรับ CUL3 การจัดลำดับแซงเจอร์ดำเนินการที่ Eurofins Genomics
การจัดตำแหน่งตามลำดับ
ลำดับโปรตีนที่คล้ายคลึงกันถูกระบุโดยใช้ NCBI Protein BLAST (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) และฐานข้อมูล eggNOG (//eggnogdb.embl.de) ลำดับที่แสดงรวมถึง KLHL3 ของมนุษย์และออร์โธโลกของมัน: Homo sapiens (NP_059111.2), Mus musculus (NP_001349344.2), Gallus gallus (XP_015149442.1), Danio rerio (XP_021328460.1), Ciona intestinalis (XP_009862126.1), Drosophila melanogaster (NP_724095.1) และ Caenorhabditis elegans (NP_001254310.1) . พาราล็อกของมนุษย์ถูกระบุโดยการวิจัยวรรณกรรม และรวม KLHL1 ถึง KLHL42 ดังที่แสดงในตารางเสริมออนไลน์ที่ 1 (สำหรับสื่อสนับสนุนออนไลน์ทั้งหมด ดูที่ www.karger.com/doi/10.1159/000521626) [23] ลำดับถูกจัดเรียงโดยใช้ Jalview เวอร์ชัน 2.10.5 [24] โครงสร้างโดเมนมาจาก UniProt (Q9UH77 เข้าถึงเมื่อวันที่ 13 เมษายน 2021) และถูกแสดงภาพโดยใช้ DOG [25]
พลาสมิดและการกลายพันธุ์ที่มุ่งเป้าไปที่ไซต์
พลาสมิด pTRE2hyg WNK4 และ pFN21A KLHL3 เป็นของขวัญอันดีจาก Dr. Shinichi Uchida (Tokyo Medical and Dental University) เพื่อแนะนำการกลายพันธุ์ของ p.R431W ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบโดยใช้ Primer X (https://www.bioinformatics.org/primerx): 5′- GATGAACACCGGTGGAGCAGTGTGG -3′ (KLHL3_ R431W{{10} }F) และ 5′- CCACACTGCTCCACCGCGTGTCATC -3′ (KLHL3_R431W_1R) สารตกค้างกลายพันธุ์จะแสดงเป็นตัวหนา การกลายพันธุ์ที่กำกับโดยไซต์ดำเนินการโดยใช้ชุดการกลายพันธุ์ที่กำกับโดยไซต์ QuikChange พร้อมด้วย PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต cDNA ได้รับการจัดลำดับ Sanger ที่ Eurofins Genomics เตรียมพลาสมิดโดยใช้ชุด QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit
การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ การเปลี่ยนถ่ายชั่วคราว และ Western Blot
เพาะเลี้ยงเซลล์ COS7 ใน DMEM + L-กลูตามีน, FBS 10% และเพนิซิลิน/สเตรปโตมัยซิน 1% (Gibco ทั้งหมด, เทอร์โม ฟิชเชอร์) สำหรับทรานส์เฟกชัน เซลล์ถูกเพาะบนเพลตหลุม 6- ที่ความหนาแน่น 1.9 × 105 เซลล์/หลุมและเติบโตจนถึงความหนาแน่นประมาณ 90% เซลล์ถูกทรานส์เฟคด้วย pTRE2hyg WNK4 1 ไมโครกรัม และ pFN21A 2 ไมโครกรัม (เวกเตอร์เปล่าหรือชนิดไวด์ KLHL3 [WT]) หรือ KLHL3 R431W cDNA โดยใช้ Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โคลนอิสระสองตัวแต่ละตัวถูกใช้สำหรับการทรานส์เฟกชัน สี่สิบแปดชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชัน เซลล์ถูกล้างใน PBS เย็นและไลซ์ใน Tris-HCl 10 มิลลิโมลาร์ (pH 7.5), NaCl 150 มิลลิโมลาร์, EDTA 1 มิลลิโมลาร์ และ 1% NP40 ซึ่งมีค็อกเทลตัวยับยั้งโปรตีเอสที่สมบูรณ์ (Roche, เมอร์ค) ไลเซตถูกปั่นเหวี่ยงที่ 20,000 กรัม เป็นเวลา 30 นาทีที่ 4 องศา และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกเก็บไว้ที่ −20 องศา ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดในการทำซ้ำ (มาตรฐาน) หรือสามซ้ำ (ตัวอย่าง) โดยการทดสอบ BCA (เพียร์ซ, เทอร์โม ฟิชเชอร์) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โปรตีนทั้งหมดประมาณ 20 ไมโครกรัมถูกแยกส่วนโดย SDSPAGE และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF (1.5 ชั่วโมง, 100 V) เมมเบรนถูกปิดกั้นในนมแห้ง 2% ใน TBST เวสเทิร์นบล็อตดำเนินการโดยใช้สารต้านฮาโลแท็กกระต่ายโพลีโคลนอล (Promega #G9281, 1:500, 4 องศาข้ามคืน) ตามด้วยการล้างและการฟักตัวด้วย IgG ต้านกระต่าย IgG ของลา (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # {{46 }}, ไดโนวา, 1:20,000, 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง), การซัก และการตรวจจับด้วยสารเคมีที่ได้รับการปรับปรุง (Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare) รอยเปื้อนถูกลอกออกโดยใช้ ROTIFree Stripping Buffer 2.0 (Carl Roth) ปิดกั้นในนมแห้ง 2% ใน TBST ข้ามคืนที่ 4 องศา และบ่มด้วยโมโนโคลนอลเมาส์แอนติ-FLAG M2 (SigmaAldrich #F1804, Merck, 1:1,{{69} }, 1.5 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง) ตามด้วย IgG ของลา IgG ป้องกันหนู IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # 715-035-151, dianova, 1:20,000, 1 ชั่วโมงที่ห้อง อุณหภูมิ) การตรวจจับ ECL การปอก และการบล็อกดังที่กล่าวข้างต้น จากนั้น บล็อตถูกบ่มด้วยโมโนโคลนอลโมสต์แอนติ{- -แอคติน (Sigma-Aldrich # A2228, เมอร์ค, 1:5,000, 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง) และ IgG แอนติ-เมาส์ IgG ของลา ตามด้วยการตรวจจับ ECL อีกครั้ง แบนด์ถูกหาปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ Image Lab บน ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad) ความเข้มของแถบที่ตรวจพบโดยแอนติบอดีต้าน HaloTag และแอนติบอดีต้าน FLAG M2 ตามลำดับ ถูกหารด้วยความเข้มที่สอดคล้องกันของแถบที่ตรวจพบโดยแอนติบอดีต้าน- - แอกติน เพื่อประเมินระดับการแสดงออกของ KLHL3, เซลล์ถูกทรานส์เฟกดังข้างต้นอย่างไรก็ตามโดยใช้ 0 ไมโครกรัม, 0.5 ไมโครกรัม, 1 ไมโครกรัม, 2 ไมโครกรัม, 4 ไมโครกรัมและ 8 ไมโครกรัมของ pFN21A KLHL3 WT หรือ R431W เจลอิเล็กโตรโฟรีซิสและการซับได้ดำเนินการตามข้างต้น สำหรับการสอบวิเคราะห์การไล่ตามไซโคลเฮกซิไมด์ เซลล์ถูกเพาะตามที่กล่าวข้างต้นและทรานส์เฟกตามข้างต้น อย่างไรก็ตาม ด้วย 2 ไมโครกรัม pFN21A KLHL3 WT หรือ 4 ไมโครกรัม KLHL3 R431W สี่สิบแปดชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชัน, 100 ไมโครโมลาร์ไซโคลเฮกซิไมด์ถูกเติม และเซลล์ถูกสลายหลังจากจุดเวลาที่ระบุไว้ ขั้นตอนการวิเคราะห์เพิ่มเติมเป็นไปตามข้างต้น
รูปที่ 2 การจำลอง MD ของโดเมน WT และ p.Arg431Trp (R431W) KLHL3 Kelch มุมมองจากบนลงล่างของโดเมน Kelch (PDBID: 4CH9) ระบายสีด้วย - ใบพัด (K1 – K6) ไซต์การกลายพันธุ์ถูกระบุด้วยดาวสีเหลือง และพื้นที่ที่สนใจจะเป็นสีเทา (สารตกค้าง 425–465) และเปปไทด์ WNK4 (ไม่รวมอยู่ในการจำลอง) มีความโปร่งใสและมีสีเทา b ความแตกต่างใน MSF ของโดเมน Kelch ที่แมปบนกระดูกสันหลังของโปรตีน ตำแหน่งการกลายพันธุ์จะแสดงด้วยดาวสีเหลือง สีแดงบ่งบอกถึงส่วนของโปรตีนที่มีความไดนามิกมากขึ้น (เสถียรน้อยกว่า) c RMSD ของโปรตีนทั้งหมด (บนสุด) สารตกค้าง 425–465 (กลาง) และกระเป๋าที่มีผลผูกพัน WNK 4- (ด้านล่าง) จากโครงสร้างผลึกสำหรับแบบจำลองการจำลองอิสระสามตัว (เส้นหนา ค่าเฉลี่ยที่ทำงานอยู่) d แปลงไวโอลินของ hbonds (ซ้าย) และระยะ COM (กลาง) ระหว่าง K3 (สารตกค้าง 425–441) และ K4 (442–465) - ใบพัดและไฟฟ้าสถิตแบบกระเป๋าผูก (ขวา) e การซ้อนทับโครงสร้างของอินเทอร์เฟซ K3 – K4 จากเฟรมสุดท้าย (1.1 μs) ของแต่ละแบบจำลอง (WT, สีน้ำเงิน; R431W, สีเทา) ด้วยโมเดลการทดลอง / เริ่มต้น (สีดำ) กระดูกสันหลังของโปรตีนจะแสดงเป็นการ์ตูน โดยมีสารตกค้าง 431 แสดงเป็นแท่ง MSF หมายถึงความผันผวนของกำลังสอง
การจำลองพลวัตของโมเลกุล
แบบจำลอง WT ขึ้นอยู่กับโครงสร้างผลึกเอ็กซ์เรย์ (PDBID: 4CH9) ของโดเมน Kelch ของมนุษย์ที่ซับซ้อนด้วยชิ้นส่วนเปปไทด์ WNK4 [26] อะตอมที่หายไปและขั้วแคปถูกเพิ่มโดยใช้ยูทิลิตี้ psfgen ในการเปลี่ยนแปลงทางสายตาของโมเลกุลเวอร์ชัน 1.9.3 [27] โมเดล KLHL3 กลายพันธุ์ (R431W) ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ Modeller เวอร์ชัน 9.18 [28] ช่วงตกค้างสุดท้ายสำหรับแต่ละระบบคือ 300–585 N- และ C-termini ของรุ่น WT และ R431W ถูกทำให้เป็นกลางโดย acetylation และ N-methylamidation ตามลำดับ สถานะการโปรตอนเริ่มต้นถูกกำหนดให้กับสารตกค้างที่สามารถไทเทรตได้แต่ละรายการตามการวิเคราะห์ด้วย PROPKA เวอร์ชัน 3.0 [29] เพปไทด์ WNK4 ถูกเอาออกจากการจำลองการผลิตเนื่องจากการแยกตัวออกจาก KLHL3 หลังจากการจำลองการปรับสมดุลเริ่มต้น
การจำลองทั้งหมดดำเนินการโดยใช้แพ็คเกจซอฟต์แวร์ GROMACS เวอร์ชัน 2021 [30] พารามิเตอร์สนามแรง CHARMM36m ใช้สำหรับอะตอมโปรตีน [31] ไอออนถูกอธิบายโดยใช้พารามิเตอร์ CHARMM เริ่มต้น และแบบจำลอง TIP3P ถูกใช้สำหรับน้ำ [32] ขั้นตอนเวลาการรวม 1 fs ถูกใช้สำหรับขั้นตอนการปรับสมดุลเริ่มต้น โดยที่ 2 fs ถูกใช้สำหรับการจำลองที่ตามมาทั้งหมด พันธะทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับไฮโดรเจนถูกจำกัดโดยใช้ LINCS [33] ปฏิกิริยาระหว่างกันของ Van der Waals แบบไม่มีพันธะถูกคำนวณโดยใช้ศักย์ของ Lennard-Jones โดยมีรัศมีการตัดที่ 1.2 นาโนเมตร แรงถูกปิดอย่างราบรื่นในช่วง 1.2–1.0 นาโนเมตร ไฟฟ้าสถิตทั้งหมดคำนวณโดยใช้วิธี Ewald [34] อนุภาคแบบตาข่ายที่เรียบขึ้น โดยมีระยะตัดในอวกาศจริง 1.2 นาโนเมตร หลังจากการจำลองเบื้องต้นในชุดไอโซคอริก-ไอโซเทอร์มอล (NVT) การจำลองต่อมาทั้งหมดได้ดำเนินการในชุดไอโซบาริก-ไอโซเทอร์มอล (NPT) ที่อุณหภูมิ 310.15 เคลวิน โดยใช้เทอร์โมสตัทการปรับความเร็วใหม่ [35] โดยมีค่าคงที่เวลา 0.5 พิโคเซคอน เทอร์โมสตัทถูกนำไปใช้แยกกันกับโปรตีนและตัวทำละลาย (เช่น น้ำและไอออน) กลุ่มเดียวกันนี้ถูกใช้เพื่อกำจัดการเคลื่อนที่ของจุดศูนย์กลางมวล (COM) แรงดัน 1 บาร์ถูกกำหนดโดยใช้ Berendsen [36] หรือ Parrinello-Rahman [37] barostat ในลักษณะไอโซโทรปิกโดยมีค่าคงที่เวลา 5 พิโคเซคอน
โมเดล WT และ R431W ได้รับการแก้ไขในกล่องลูกบาศก์ที่มีขนาดเริ่มต้น 1.2 × 1.2 × 1.2 นาโนเมตร แต่ละระบบถูกทำให้เป็นกลางด้วย NaCl 150 มิลลิโมลาร์ หลังจากการลดพลังงานที่ชันที่สุดในช่วงเริ่มต้นให้เหลือน้อยที่สุด แต่ละระบบจะได้รับการปรับสมดุลในชุด NVT เป็นเวลา 5 ns โดยมีข้อ จำกัด ตำแหน่งบนอะตอมโปรตีนทั้งหมด ขั้นตอนการปรับสมดุลที่ตามมาได้ดำเนินการในชุด NPT เป็นเวลา 5 ns โดยมีข้อ จำกัด เช่นเดียวกับในขั้นตอนก่อนหน้า อุปกรณ์ยึดตำแหน่งถูกถอดออกจากโซ่ด้านข้างทั้งหมดสำหรับการจำลองการปรับสมดุล 5- สุดท้าย โครงสร้างเริ่มต้นสามโครงสร้างถูกสร้างขึ้นจากขั้นตอนสุดท้ายของการปรับสมดุลสำหรับการจำลองการผลิตอิสระของระบบ WT และ R431W โดยถอดข้อจำกัดตำแหน่งทั้งหมดออก การจำลองการผลิตแต่ละครั้งถูกจำลองเป็นเวลา 1.1 µs; 0.1 µs แรกถูกลบออกจากการวิเคราะห์
เพื่อประเมินความเสถียรของโครงสร้างตลอดการจำลอง คำนวณค่าเบี่ยงเบนรากกำลังสองเฉลี่ย (RMSDs) จากโครงสร้างผลึกสำหรับอะตอม C ของโปรตีนทั้งหมด เช่นเดียวกับส่วนต่อประสาน K3–K4 (สารตกค้าง 425–465) และ กระเป๋าเข้าเล่ม WNK4- (สารตกค้าง 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528 และ 577) ค่าเฉลี่ยรันของการติดตาม RMSD ได้รับการคำนวณและซ้อนทับกับข้อมูลดิบ
ผลกระทบของการกลายพันธุ์ต่อความเสถียรของโครงสร้างถูกมองเห็นโดยการคำนวณความแตกต่างในความผันผวนกำลังสองเฉลี่ยของอะตอมโปรตีน C โดยเฉลี่ยบนเฟรมและแบบจำลอง และการแมปกับโครงสร้างโปรตีน WT การแสดงภาพโปรตีนทั้งหมดถูกสร้างขึ้นโดยใช้ ChimeraX [38] ผลของการกลายพันธุ์ R431W บนอินเทอร์เฟซ K3 (สารตกค้าง 425–441) ถึง K4 (สารตกค้าง 442–465) มีลักษณะเฉพาะโดยการวิเคราะห์พันธะไฮโดรเจน (H-bond) และระยะห่าง COM ระหว่างทั้งสองกลุ่ม ประเมินพันธะ H ในแต่ละเฟรมโดยใช้เครื่องมือ GROMACS gmx hbond โดยมีระยะตัดและมุม 3.5 Å และ 30 องศา ตามลำดับ ประเมินระยะทาง COM ในแต่ละเฟรมในทำนองเดียวกัน - การกระจายของทั้งระยะทาง Hbonds และ COM ถูกมองเห็นเป็นแผนไวโอลิน คำนวณค่าเฉลี่ยตามวิถีและแบบจำลอง
ไฟฟ้าสถิตของช่องเข้าเล่ม WNK4- คำนวณโดยใช้ g_elpot [39] ช่วงเวลาของศักย์ไฟฟ้าสถิตในช่องเข้าเล่มได้รับการประเมินโดยการกำหนดปริมาตรทรงกลมที่มีรัศมี 8 Å โดยมีศูนย์กลางอยู่ที่จุดศูนย์กลางทางเรขาคณิตของสิ่งตกค้างที่ประกอบรวมด้วยช่องเข้าเล่ม เพื่อประเมินความแปรปรวนของไฟฟ้าสถิต 50- ค่าเฉลี่ยบล็อกถูกคำนวณ การกระจายศักย์ไฟฟ้าสถิตภายในช่องรวมสำหรับการกลายพันธุ์ WT และ R431W ถูกมองเห็นเป็นแผนไวโอลิน โดยมีค่าเฉลี่ยที่คำนวณมากกว่า 50- บล็อกและวิถีโคจร
บริการสนับสนุนของ Wecistanche - ผู้ส่งออก cistanche ที่ใหญ่ที่สุดในประเทศจีน:
อีเมล:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/โทรศัพท์:+86 15292862950
เลือกซื้อรายละเอียดข้อมูลจำเพาะเพิ่มเติม:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-ร้านค้า
