โปรโตคอลการล้างและบวมที่รวดเร็วและง่ายดายสำหรับการถ่ายภาพ 3 มิติในแหล่งกำเนิดของไตในเครื่องชั่ง

edmund.chen@wecistanche.com

ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มีการเผยแพร่โปรโตคอลไมโครสโคปีแบบใช้แสงจำนวนมากสำหรับการแสดงภาพโครงสร้างระดับนาโนในไต.โปรโตคอลเหล่านี้นำเสนอเครื่องมือใหม่ๆ แก่นักวิจัยในการประเมินทั้งลักษณะทางกายวิภาคและการหลุดลอกของกระบวนการที่เท้า ตลอดจนการกระจายโปรตีนในกระบวนการที่เท้า ไดอะแฟรมกรีด และในเยื่อหุ้มชั้นใต้ดินของไต อย่างไรก็ตาม โปรโตคอลเหล่านี้อาจเกี่ยวข้องกับการใช้กล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงพิเศษที่ซับซ้อนต่างๆ หรือโปรโตคอลการเตรียมตัวอย่างที่มีความยาว ที่นี่ เราขอนำเสนอขั้นตอนที่ง่ายและรวดเร็วซึ่งใช้เวลาห้าชั่วโมงสำหรับการสร้างภาพสามมิติของไตสัณฐานวิทยาในทุกขนาดความยาว โปรโตคอลนี้รวมเอาแนวคิดเกี่ยวกับการหักล้างด้วยแสงและการขยายเนื้อเยื่อเพื่อสร้างการบวมเล็กน้อย ซึ่งเพียงพอสำหรับการแก้ไขโครงสร้างระดับนาโนโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลแบบธรรมดา เราแสดงให้เห็นว่าโปรโตคอลนี้สามารถนำมาใช้เพื่อให้เห็นภาพลักษณะทางพยาธิวิทยาที่หลากหลายทั้งในหนูและมนุษย์ไต. ดังนั้น โปรโตคอลที่รวดเร็วและง่ายดายของเราสามารถเป็นประโยชน์สำหรับการประเมินด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบธรรมดาของไตความสมบูรณ์ของเนื้อเยื่อทั้งในการวิจัยและอาจเป็นกิจวัตรทางคลินิกในอนาคต

CISTANCHE จะปรับปรุงการทำงานของไต/ไต

โปรโตคอลเชิงแสงจำนวนมากสำหรับการสร้างภาพโครงสร้างระดับนาโนในไตได้รับการนำเสนอในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาI- พลังของเทคนิคใหม่เหล่านี้เป็นเครื่องมือสำหรับการหาปริมาณกายวิภาคศาสตร์และพยาธิวิทยาของอุปสรรคการกรองได้รับการยกตัวอย่างในสิ่งพิมพ์ล่าสุดจากกลุ่มของเราและอื่น ๆ5 เปอร์เซ็นต์ ,10แม้ว่าจะมีประสิทธิภาพ แต่โปรโตคอลออปติคัลทั้งหมดเหล่านี้ต้องใช้ กล้องจุลทรรศน์แบบไม่ จำกัด การเลี้ยวเบนขั้นสูงหรือเกี่ยวข้องกับการนำเคมีพอลิเมอร์ที่ซับซ้อนเข้าไปในตัวอย่างเพื่อขยายตัวอย่างและ/หรือขยายทางกายภาพ โปรโตคอลจำนวนมากยังใช้เวลานานและต้องใช้แรงงานจำนวนมาก ความซับซ้อนที่เพิ่มขึ้นนี้อาจเป็นสิ่งที่ขัดขวางไม่ให้วิธีการใหม่เหล่านี้ถูกใช้เป็นประจำโดยนักวิจัยและนักพยาธิวิทยาทางคลินิก นอกจากนี้ โปรโตคอลจำนวนมากไม่สามารถเข้าถึง 3-ภาพสามมิติ (3D) ของกระบวนการเท้า (FPs) ที่ลึกเกินกว่า 5-15 อืมในเชิงลึก-1,7,8 ดังนั้นเราจึงมุ่งเป้าไปที่ พัฒนาโปรโตคอลออปติคัลออปติกทั้งหมดที่เรียบง่ายและรวดเร็วซึ่งชัดเจนและขยายพื้นที่ไตตัวอย่างเนื้อเยื่อเพียงพอสำหรับการวิเคราะห์ในแหล่งกำเนิด 3 มิติที่มีความละเอียดสูงของไตกายวิภาคศาสตร์และพยาธิวิทยาโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบจำกัดการเลี้ยวเบนแบบธรรมดาที่มีอยู่ในสถาบันชีววิทยาศาสตร์และพยาธิวิทยาเกือบทั้งหมดการลดความซับซ้อนของโปรโตคอลก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่าการนำพอลิเมอร์อะคริลาไมด์เข้าไปในตัวอย่างที่มีพาราฟอร์มัลดีไฮด์คงที่สามารถละเว้นได้โดยสิ้นเชิงในขณะที่ยังคงรักษาความสมบูรณ์ของเนื้อเยื่อในการกวาดล้างโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) การศึกษาอื่นแสดงให้เห็นว่าตัวอย่างเนื้อเยื่อสามารถขยายได้มากกว่า 2 เท่าโดยใช้โปรโตคอลที่ปราศจากโพลีเมอร์อย่างง่ายโดยอิงจากการแช่ในสารละลายในน้ำต่างๆ2 ดังนั้นเราจึงลบการแช่อะคริลาไมด์ออกจากโปรโตคอลที่ตีพิมพ์ที่น่าเบื่อและซับซ้อนของเรา² และเปลี่ยน ตัวกลางฝังตัวอย่างเพื่อให้เกิดอาการบวมเล็กน้อย (1.3-เท่าเชิงเส้น)ไตตัวอย่างเนื้อเยื่อ เรายังได้ความละเอียดที่มีประสิทธิภาพสูงเพียงพอสำหรับการแสดงภาพ 3 มิติของ podocyte FP และเยื่อหุ้มไตชั้นใต้ดิน (GBM) โดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบเดิม

คำสำคัญ:glomerulosclerosis ปล้องโฟกัส; โรคไต IgA; โพโดไซต์; การตรวจชิ้นเนื้อไต; พยาธิวิทยาของไต; ไต

ผลลัพธ์

ล้างตาและบวมเล็กน้อยของเนื้อเยื่อไตโปรโตคอลที่รัก / บวมอย่างง่ายถูกแสดงเป็นแผนผังในรูปที่ la โปรดทราบว่าขั้นตอนการขจัดไขมันออกจาก SDS ไม่ได้เพิ่มเข้าไปเพื่อความโปร่งใสเชิงแสงเป็นหลัก แต่เพื่อให้แน่ใจว่ามีการบวมตัวที่เพียงพอของตัวอย่าง7 นอกจากนี้ เมื่อละเว้นการแยกไขมันออก คุณภาพการย้อมสีไม่ดี (รูปที่เสริม SlA) เราแสดงให้เห็นว่าการแยกไขมันออกอย่างรวดเร็วที่ 70 องศาเป็นเวลา 1 ชั่วโมงให้ผลลัพธ์ที่ดีโดยไม่เกิดการเสื่อมสภาพของตัวอย่างที่อุณหภูมิสูงขึ้น (รูปที่ S1B เสริม) ตามที่รายงานโดย Murakami et al. โมเลกุลที่คล้ายยูเรียและยูเรียสามารถทำให้ตัวอย่างเนื้อเยื่อพองตัวได้อย่างมีประสิทธิภาพ ส่งผลให้ความละเอียดเชิงพื้นที่เพิ่มขึ้นอย่างมีประสิทธิภาพ เราจึงเติมยูเรีย 4 โมลาร์ในส่วนผสมที่มีฟรุกโตส 80 เปอร์เซ็นต์ (น้ำหนัก/น้ำหนัก) (เรียกว่า FRUIT) ซึ่งส่งผลให้ปัจจัยการบวมตัวเป็นเส้นตรงเท่ากับ -1.3(รูปปอนด์)

เพื่อลดระยะเวลาในการติดฉลาก เราใช้แอนติบอดีปฐมภูมิที่ย้อมด้วยสีย้อม ในขั้นต้น เมื่อใช้แอนติบอดีต่อเนฟรินสีย้อมคอนจูเกตในบัฟเฟอร์การย้อมสีมาตรฐาน (น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตกับ Tween 20) ประสิทธิภาพสัญญาณและการติดฉลากไม่สูงพอที่จะร่างโครงร่าง FP แต่ละรายการ อย่างไรก็ตาม โดยการใช้บัฟเฟอร์การย้อมสีทางเลือก HEPES-TSC ทำให้คุณภาพการย้อมสีเพิ่มขึ้นจนถึงระดับที่น่าพอใจ (รูปที่ S1C เสริม) เมื่อเทียบกับโปรโตคอลที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบธรรมดา โปรโตคอล 5-ชั่วโมงที่ง่ายและรวดเร็วของเรามีประสิทธิภาพเหนือกว่าโปรโตคอลเหล่านี้ในพารามิเตอร์ที่จำเป็นหลายประการ (รูปที่ lc-f) โปรโตคอลที่นำเสนอโดย Pullman et al.' โดยรวมเร็วขึ้นเล็กน้อย แต่มีข้อเสียคือต้องใช้กล้องจุลทรรศน์ส่องสว่างที่มีโครงสร้างที่มีความละเอียดสูงและใช้การแช่แข็งแบบบาง ซึ่งไม่รวมการเข้าถึงความลึกของภาพที่มีขนาดใหญ่ ข้อสังเกต โปรโตคอลของเรามีความซับซ้อนน้อยกว่าการฝังพาราฟินมาตรฐานหรือการแช่แข็งด้วยความเย็น เมื่อพิจารณาพารามิเตอร์ที่ประเมินทั้งหมดแล้ว

CISTANCHE จะปรับปรุงไต/ความล้มเหลวของไต

การปรับให้เหมาะสมและการตรวจสอบโปรโตคอลของเราสำหรับการแก้ไขกระบวนการเท้าเนื่องจากโปรโตคอลของเราให้ปัจจัยบวมปานกลางที่ 1.3 พารามิเตอร์การถ่ายภาพคอนโฟคอลจึงต้องได้รับการปรับให้เหมาะสมเพื่อให้ได้กำลังการแยกที่เพียงพอสำหรับการถ่ายภาพ FP หนูไตตัวอย่างได้รับการรักษาตามโปรโตคอลและย้อมสีสำหรับเนฟรินโดยใช้ฟลูออโรฟอร์ที่แตกต่างกัน ความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลขึ้นอยู่กับทั้งขนาดรูเข็มและความยาวคลื่นของแสงกระตุ้น/การแผ่รังสี15 ดังนั้นเราจึงใช้เส้นผ่านศูนย์กลางรูเข็มที่เล็กกว่า 0.3 หน่วยอากาศถ่ายเท (AU) ร่วมกับการเปล่งแสงสีเขียว ย้อม Alexa Fluor 488 และด้วยวิธีนี้ได้รับความละเอียดที่เพียงพอในการแก้ไข FP ในเมาส์ wild-type (WT)ไต(รูปที่ 2a). ดังนั้น เมื่อใดก็ตามที่จะต้องมองเห็น FP ของเมาส์ ฟลูออโรฟอร์ที่มีความยาวคลื่นกระตุ้นสูงสุด 488 นาโนเมตรจะถูกใช้ ภายใต้เงื่อนไขการถ่ายภาพที่ปรับให้เหมาะสมเหล่านี้ เราสามารถมองเห็นโกลเมอรูไลของเมาส์ทั้งหมดในรูปแบบ 3 มิติที่ความละเอียดที่มีประสิทธิภาพ -115 นาโนเมตร ซึ่งดีพอที่จะแก้ไข FP แต่ละตัวได้ (รูปที่ 2b-e) ยิ่งไปกว่านั้น เราแสดงให้เห็นว่ามีความลึกในการแทรกซึมของแอนติบอดีอย่างน้อย 70 μm ด้วยการติดฉลากอย่างรวดเร็ว (รูปที่ S2A-C เสริม) การใช้วัตถุประสงค์ของกลีเซอรอลพร้อมปลอกคอแก้ไข ช่วยให้เข้าถึงความลึกของ Z ได้กว้างกว่าโปรโตคอลที่พัฒนาก่อนหน้านี้ ยกเว้นโปรโตคอลการล้าง/กระตุ้นการลดการปล่อยมลพิษ เนื่องจากความละเอียดในแนวแกนของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลนั้นแย่กว่าความละเอียดด้านข้างประมาณ 3 เท่า ดังนั้นเส้นเลือดฝอยจึงควรถูกจัดวางในระนาบ xy เพื่อแก้ไข FP ได้อย่างเหมาะสมที่สุด เราแสดงให้เห็นว่าด้วยโปรโตคอลของเรา เราสามารถค้นหาพื้นที่มากมาย (มากถึง 25) สำหรับการถ่ายภาพในแต่ละโกลเมอรูลัส (รูปที่ S2D เสริม) ทำให้เราสามารถรวบรวมข้อมูลจำนวนมากเพื่อตรวจจับการเปลี่ยนแปลงที่ละเอียดอ่อนในโครงสร้างกั้นการแทรกซึม สิ่งนี้แสดงให้เห็นถึงความสำคัญของการเข้าถึงมิติความลึกเมื่อทำการวิเคราะห์เชิงปริมาณของปริมาณงานสูงเกี่ยวกับความสมบูรณ์ของไต ที่สำคัญ เรายังตรวจสอบความถูกต้องของโปรโตคอลสำหรับการแก้ไข FP ในวัสดุของผู้ป่วย (รูปที่ 2f และ g) ซึ่งมีความท้าทายน้อยกว่าเมื่อเทียบกับหนู เนื่องจาก FP ของมนุษย์มีขนาดใหญ่กว่า นอกจากนี้ การใช้เลกตินจมูกข้าวสาลี agglutinin (WGA) เลกตินที่มีความสัมพันธ์กับไกลโคคาลิกซ์ของ FP เรายังสามารถแก้ไข FP ในลักษณะภาคตัดขวางได้ทั้งในตัวอย่างเมาส์และมนุษย์ (รูปที่ 2 ชั่วโมงและ i) นอกจากนี้ เราหาค่าเนฟรินด้วยการแปลที่คาดหวังในเยื่อหุ้มร่อง ซึ่งแสดงให้เห็นว่าเราสามารถรับข้อมูลเกี่ยวกับการแปลโปรตีนได้นอกเหนือจากข้อมูลทางสัณฐานวิทยา

พยาธิวิทยาอุปสรรคการกรองในตัวอย่างเมาส์ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ '-,5,6,9,10 en face FP Imaging of the slit diaphragm can be ready used to visualize and quantify FP effacement. เรายืนยันว่าวิธีการนี้สามารถนำไปใช้กับโปรโตคอลใหม่ของเราได้โดยใช้แบบจำลองเมาส์ที่เผยแพร่ล่าสุดสำหรับ focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) (รูปที่ 3) โดยการย้อมสีเนฟริน รูปแบบไดอะแฟรมกรีดสามารถมองเห็นได้ใน 3 มิติในโกลเมอรูไลทั้งหมดของ WT และหนูที่กลายพันธุ์ (รูปที่ 3a และ b) ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้5 ความยาวของไดอะแฟรมกรีดต่อพื้นที่สามารถวัดได้แบบกึ่งอัตโนมัติ และการวิเคราะห์นี้ให้ผลลัพธ์ที่สอดคล้องกับสิ่งที่ได้รับการเผยแพร่ก่อนหน้านี้สำหรับเมาส์บรรทัดนี้'(รูปที่ 3c) นอกจากนี้ โกลเมอรูลาร์คาพิลลารีถูกถ่ายภาพในส่วนตัดขวางซึ่งแสดงทั้งการแผ่ออกของ FP เช่นเดียวกับการเปลี่ยนแปลงของ GBM(รูปที่ 3d-f); ดูวิธีการเสริมและรูปที่ S3 สำหรับรายละเอียดของการวัด GBM

พยาธิวิทยาอุปสรรคการกรองในตัวอย่างของมนุษย์เพื่อตรวจสอบความถูกต้องของโปรโตคอลของเราเพิ่มเติมสำหรับการใช้งานทางคลินิกที่เป็นไปได้ เราได้นำไปใช้กับเนื้อเยื่อของมนุษย์จากผู้ป่วยที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรค . ชนิดต่างๆโรคไต. ผู้ป่วยสองรายที่เป็นโรคไตที่มีมา แต่กำเนิด ไม่ว่าจะมีการกลายพันธุ์แบบ homozygous ในยีน NPHS1 (เข้ารหัสสำหรับ nephrin) หรือการกลายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกับทรานส์ในยีน TRPC6 และ NPHS2 (เข้ารหัสสำหรับช่อง TRPC6 และ podocin) นอกจากนี้เรายังวิเคราะห์ผู้ป่วย 2 รายที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรค FSGS และโรคที่มีการเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด เราสามารถเห็นภาพและวัดลักษณะเด่นทั่วไปของโรคไตเช่น FP effacement และการเปลี่ยนแปลง GBM (รูปที่ 4) สามารถรับรูปภาพได้ทั้งต่อหน้า (รูปที่ 4a-e) และจากด้านข้าง (รูปที่ 4g-k) ยิ่งไปกว่านั้น เราสังเกตเห็นการไม่มีเนฟรินที่คาดไว้ในไดอะแฟรมแบบผ่าของผู้ป่วยที่มีการกลายพันธุ์ NPHS1 (รูปที่ 4b และ h) สำหรับตัวอย่างเมาส์

(รูปที่ 3) ข้อมูลการถ่ายภาพสามารถประเมินในเชิงปริมาณได้ (รูปที่ 4f และ l และรูปที่ S4A และ B เพิ่มเติม)

ข้อสังเกต พบว่า GBM หนาขึ้นอย่างไม่คาดคิดในผู้ป่วยที่ได้รับการวินิจฉัยเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม การควบคุมไตเทียมไตในรูปที่ 4 นำมาจากผู้ป่วยสูงอายุ ในขณะที่ตัวอย่างอื่นๆ ทั้งหมดมาจากทารกหรือเด็ก เนื่องจากความหนาของ GBM เพิ่มขึ้นตามอายุ (รูปที่ S5A-E) อาจมีความหนามากกว่าปกติหากเปรียบเทียบกับผู้ป่วยกลุ่มควบคุมที่มีอายุเท่ากัน นอกจากนี้เรายังตรวจสอบด้วยว่าโปรโตคอลของเราไม่แนะนำสิ่งประดิษฐ์บวมตามอายุ (รูปที่เสริม S5F-H) และกลยุทธ์การวัด GBM ที่ต่างกันให้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน (รูปที่เสริม S5I และ D)

พยาธิวิทยาขนาดใหญ่ในตัวอย่างหนูและมนุษย์เพราะไม่เพียงแต่มาตราส่วนกั้นการกรองเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการเปลี่ยนแปลงทางเนื้อเยื่อวิทยาด้วยไตสัณฐานวิทยาเป็นที่สนใจของทั้งนักวิจัยและแพทย์ เราตรวจสอบความเป็นไปได้ของการใช้โปรโตคอลของเราในการประเมินลักษณะทางสัณฐานวิทยาขนาดใหญ่ผ่านการวิเคราะห์ทางเนื้อเยื่อวิทยาโดยใช้การเรืองแสง เราแสดงให้เห็นว่าการใช้วัตถุประสงค์การขยายที่ต่ำกว่า เราสามารถตรวจจับพยาธิสภาพขนาดใหญ่และความแตกต่างในการแสดงออกของโปรตีนในทั้งตัวอย่างของมนุษย์ (รูปที่ S6) และตัวอย่างเมาส์ (รูปที่ S7)

การแสดงภาพการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาในผู้ป่วยที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรคไต FSGS และ IgAเพื่อแสดงตัวอย่างเพิ่มเติมของการใช้โปรโตคอลที่เป็นไปได้ในตัวอย่างผู้ป่วย เราจึงตรวจสอบว่าเราสามารถตรวจหาลักษณะทางพยาธิวิทยาของ FSGS ของประเภทเซลล์ได้หรือไม่ เราสามารถเห็นภาพลักษณะทางพยาธิวิทยาส่วนใหญ่ที่กล่าวถึงในคำแถลงจากนักพยาธิวิทยา ซึ่งรวมถึงโฟกัสรวม/ส่วนการตีบตัน การฝ่อของท่อ และการเกิดเซลล์มากเกินไปในเยื่อบุผนังหลอดเลือดในเส้นเลือดฝอยเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีมาตรฐานทองคำในปัจจุบัน (รูปที่ 5a-j) การเปรียบเทียบเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณกับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (EM) แสดงให้เห็นผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันโดยใช้ทั้งสองวิธี (รูปที่ 5k และ l และรูปที่ S4 เพิ่มเติม ดูวิธีการเพิ่มเติมสำหรับการอภิปรายเกี่ยวกับการวัดความกว้าง FP)

CISTANCHE จะช่วยเพิ่มอาการปวดไต/ไต

นอกจากนี้เรายังใช้โปรโตคอลนี้กับตัวอย่างชิ้นเนื้อจากผู้ป่วยที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรคไต IgA (IgAN) (รูปที่ 6) และสามารถยืนยันการแสดงภาพลักษณะการวินิจฉัยต่างๆ ได้ ไม่พบพยาธิสภาพที่รุนแรงในสิ่งกีดขวางการกรอง (รูปที่ 6a และ b) และการวิเคราะห์เปรียบเทียบส่งผลให้ไม่มีความแตกต่างที่ชัดเจนระหว่าง EM และโปรโตคอลของเรา (รูปที่ 6c และ d) ต่อไป มิญญญวิทยาของไตยืมได้รับการประเมินด้วยทั้งมิญญวิทยามาตรฐาน (รูปที่ 6e)และ "จุลกายวิภาคศาสตร์เรืองแสง" (รูปที่ 6f) เราสามารถเห็นภาพการเปลี่ยนแปลง (หรือขาดการเปลี่ยนแปลง) ที่กล่าวถึงในคำชี้แจงจากนักพยาธิวิทยา เช่น การแทรกซึมของเซลล์คั่นระหว่างหน้า (รูปที่ 6g และ h) เส้นโลหิตฝอยปกติ (รูปที่ 6i) และการขยายตัว/hypercellularity ของ mesangial (รูปที่ 6j) การสร้างภูมิคุ้มกันโดยใช้แอนติบอดี IgA เผยให้เห็นคราบสะสมอย่างชัดเจนทั้งในระดับขนาดใหญ่ (รูปที่ 6k และ l) และในรายละเอียด (รูปที่ 6 ม.) ด้วยรูปแบบที่เทียบเท่ากับที่เห็นในอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์มาตรฐาน (Fgure 6n และ o) ในที่สุด การถ่ายภาพด้วย FP แสดงให้เห็นการหลุดลอกเล็กน้อยบางส่วน (รูปที่ 6p และ q) คุณลักษณะทางพยาธิวิทยาที่เราสามารถตรวจพบได้ด้วยโปรโตคอลของเราได้สรุปไว้ในตารางเสริม S1

อภิปรายผล

ที่นี่เรานำเสนอโปรโตคอลสำหรับการแสดงภาพปริมาณงานสูงของไตโครงสร้างในทุกขนาดความยาวที่ทั้งเร็วและง่ายกว่าโปรโตคอลที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้สำหรับการวิเคราะห์ FP และการถ่ายภาพสิ่งกีดขวางการกรองไตในไตเราแสดงให้เห็นว่าความละเอียดที่เราบรรลุนั้นสูงพอที่จะสรุปเกี่ยวกับพยาธิสภาพในอุปสรรคการกรองโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลอย่างง่าย ซึ่งเป็นเครื่องมือมาตรฐานที่มีอยู่แล้วในศูนย์วิจัยและห้องปฏิบัติการพยาธิวิทยาส่วนใหญ่ ความสามารถ 3D ของโปรโตคอลมีความสำคัญเมื่อทำการถ่ายภาพของ FP เนื่องจากสามารถเข้าถึงปริมาณการสร้างภาพขนาดใหญ่ได้ ทำให้สามารถระบุและคัดกรองบริเวณที่เหมาะสมของตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณ

การค้นพบที่สำคัญของการศึกษาของเราคือ โปรโตคอลของเราไม่เพียงแต่ดำเนินการเสริมและเป็นประโยชน์เมื่อเปรียบเทียบกับโปรโตคอลมาตรฐานที่ใช้ในปัจจุบันสำหรับการวิเคราะห์มาตรฐานของไตเนื้อเยื่อ. นอกจากนี้ยังสามารถรวมเวิร์กโฟลว์เหล่านี้เป็นโปรโตคอลเดียว โดยสามารถประหยัดได้อย่างเห็นได้ชัดในแง่ของชั่วโมงการทำงานและวัสดุ/รีเอเจนต์/อุปกรณ์ที่จำเป็น อย่างไรก็ตาม เนื่องจากการวิเคราะห์อิงตามแอนติบอดีในระดับมาก ราคาของรีเอเจนต์การติดฉลากจึงสูงพอสมควร (ประมาณ 20e ต่อตัวอย่าง) ซึ่งก็เป็นจริงเช่นกันสำหรับโปรโตคอลที่ใช้การเรืองแสงอื่น ๆ ที่นำเสนอในบทความนี้ (รวมถึงอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ปกติ)

ในเวอร์ชันที่เร็วที่สุดของโปรโตคอล เราใช้แอนติบอดีปฐมภูมิที่ย้อมด้วยสีย้อมที่ให้คุณภาพการย้อมที่เพียงพอสำหรับการแก้ไข FP อย่างไรก็ตาม สัญญาณที่ได้จะต่ำกว่าเสมอเมื่อเปรียบเทียบกับสัญญาณจาก 2-ขั้นตอนหลัก/รอง นอกจากนี้ แอนติบอดีคอนจูเกตปฐมภูมิที่ใช้ในการศึกษายังไม่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์และต้องถูกคอนจูเกตภายในองค์กร ดังนั้น สำหรับบางแอปพลิเคชัน โปรโตคอลการย้อมสี 2-ขั้นตอนหลัก/รองยังคงน่าจะดีกว่า โดยเพิ่ม 2 ชั่วโมงให้กับโปรโตคอล การศึกษาล่าสุดได้ประยุกต์ใช้กล้องจุลทรรศน์ Airyscan กับไตเนื้อเยื่อ ซึ่งใช้การตั้งค่ารูเข็มแบบแปรผันบนเครื่องตรวจจับอาร์เรย์ของกล้องขนาดเล็ก ร่วมกับการประมวลผลภาพแบบแยกส่วนและกำหนดสัญญาณใหม่7,18 ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นว่าด้วยการบวมเล็กน้อยและสภาพการย้อมสีและการถ่ายภาพที่ยอดเยี่ยมตามมา การถ่ายภาพคอนโฟคอลแบบธรรมดาด้วย

รูเข็มแบบปิดให้ความละเอียดเพียงพอโดยไม่จำเป็นต้องประมวลผลภาพภายหลังทางคณิตศาสตร์ ในงานนี้ เรานำเสนอข้อมูลเปรียบเทียบสำหรับโปรโตคอลและวิธีการมาตรฐานสำหรับการประเมินพยาธิวิทยาในตัวอย่างผู้ป่วย อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ได้ดำเนินการกับผู้ป่วยจำนวนน้อย และการศึกษาเพิ่มเติมมีความสำคัญต่อการศึกษาว่าโปรโตคอลนี้สามารถใช้เพื่อตรวจหาพารามิเตอร์ทางพยาธิวิทยาที่มีอยู่มากมายในประเภทอื่น ๆ ได้หรือไม่โรคไตเช่นกัน. เพื่อให้บรรลุสิ่งนี้ จะต้องเริ่มต้นความพยายามในการทำงานร่วมกันที่มุ่งเน้นซึ่งเกี่ยวข้องกับทั้งนักพยาธิวิทยา ผู้เชี่ยวชาญด้านการเตรียมตัวอย่าง และผู้เชี่ยวชาญด้านการถ่ายภาพ การตรวจสอบอย่างถี่ถ้วนนี้ไม่อยู่ในขอบเขตของการศึกษาพิสูจน์หลักการ ซึ่งมีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาโปรโตคอลเชิงแสงที่รวดเร็วและรวดเร็วสำหรับการถ่ายภาพที่มีความละเอียดสูงของไต.นอกจากนี้ ควรเน้นว่าความละเอียดของโปรโตคอลของเราอยู่ไกลจาก EM และไม่สามารถแก้ไขได้ ตัวอย่างเช่น ในบางกรณี EM ก็ยังจำเป็นสำหรับการวินิจฉัยที่ถูกต้อง

ในการศึกษานี้ เราใช้การวัดความยาวแบบดิบโดยไม่มีการแก้ไขสำหรับสิ่งประดิษฐ์ในการแบ่งส่วนที่เกิดจากการแบ่งส่วนทางแสงหรือทางกายภาพที่ไม่ใช่มุมฉากของโครงสร้างที่วัด (GBM หรือ FP) มีเหตุผลหลัก 2 ประการในการแสดงข้อมูลในแบบฟอร์มนี้ ประการแรก การแก้ไขสำหรับการแบ่งส่วนสิ่งประดิษฐ์ในขณะที่ยังคงรักษาข้อมูลเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงระดับนาโน (เช่น GBM ที่ "เป็นหลุมเป็นบ่อ" ที่ไม่สม่ำเสมอ) ไม่ใช่เรื่องง่าย ประการที่สอง ในตัวอย่างที่โปร่งใสของเรา เราเลือกระนาบการถ่ายภาพเสมอ

โดยที่โครงสร้างที่กำลังศึกษาอยู่ในแนวตั้งฉากกับระนาบการถ่ายภาพให้ได้มุมฉากมากที่สุด ดังนั้นการแบ่งส่วนจึงไม่ใช่การสุ่ม ทำให้การวิเคราะห์วัตถุในการแบ่งส่วนมีความซับซ้อนมากขึ้น ด้วยเหตุนี้ ค่าเฉลี่ยที่นำเสนอในการศึกษานี้จึงน่าจะประเมินค่าสูงไปเล็กน้อย และวัตถุในการแบ่งส่วนมีส่วนทำให้เกิดการแพร่กระจายของข้อมูลในแผนภาพแบบกระจาย สำหรับการวัดโครงสร้างที่แก้ไขด้วยการแบ่งส่วนในอนาคตโดยไม่สูญเสียความแปรผันของข้อมูลจริง อาจใช้เวอร์ชันที่แก้ไขของวิธีการแก้ไขสิ่งแปลกปลอมของการแบ่งส่วนที่มีอยู่ เช่น วิธีสกัดกั้นมุมฉาก!920

ความสามารถในการแยกพารามิเตอร์ทางพยาธิวิทยาออกจากเคลียร์ไตเนื้อเยื่อที่ใช้ทั้งตัวอย่างที่ไม่มีฉลาก (เรืองแสงอัตโนมัติ) และตัวอย่างที่ติดฉลากเรืองแสงได้รับการแสดงให้เห็นเมื่อเร็ว ๆ นี้ - นอกจากนี้การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้แสดงให้เห็นว่า "จุลกายวิภาคเสมือน" สามารถทำได้โดยใช้การเรียนรู้เชิงลึก al-for รายการในภาพ autofluorescence และการแบ่งส่วนตามเครือข่ายประสาทและ มีการจำแนกประเภทของโรคไต การผสมผสานวิธีการเตรียมตัวอย่างแบบใหม่ (เช่น รายงานที่นี่) กับเครื่องมือวิเคราะห์ภาพแบบใหม่ทำให้เกิดความเป็นไปได้ทางดิจิทัลที่น่าสนใจมากมายในอนาคต และเราน่าจะเห็นการเปลี่ยนแปลงในจินตนาการและวิเคราะห์ตัวอย่างไตทั้งในการวิจัยและในคลินิก

วัสดุและวิธีการ หนูเมาส์และเนื้อเยื่อไตของมนุษย์การทดลองเกี่ยวกับเมาส์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยสำนักงานแห่งรัฐนอร์ทไรน์-เวสต์ฟาเลีย กรมธรรมชาติ สิ่งแวดล้อม และการคุ้มครองผู้บริโภคของเยอรมนี และดำเนินการตามหลักเกณฑ์ของยุโรป ระดับชาติ และระดับสถาบัน ใช้หนูที่มีพื้นหลัง C57BL/6N 100 เปอร์เซ็นต์ หลังจากการชักนำให้เกิดการดมยาสลบด้วยคีตามีนและไซลาซีน หนูถูกการุณยฆาตโดยการไหลเวียนของหัวใจด้วยสารละลายเกลือที่สมดุลของแฮงค์และถูกตรึงตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง

เอกสารสำหรับผู้ป่วยได้รับจากเด็ก 2 คนที่เป็นโรคไตที่ดื้อต่อสเตียรอยด์เนื่องจากการกลายพันธุ์ของจุดใน NPHSI หรือการกลายพันธุ์ของจุดรวมของเฮเทอโรไซกัสใน TRPC6 และ NPHS2 รวมถึงผู้ป่วย 3 รายที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรคต้อหินในปล้องโฟกัส โรคที่มีการเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด และโรคไตจาก IgA ตามลำดับ เก็บเนื้อเยื่อมนุษย์ควบคุมจากผู้ป่วยที่ได้รับการตัดไตเนื่องจากไตเนื้องอก ตัวอย่างเนื้อเยื่อที่ผ่าออกจากขั้ว nontumorous ของไตแสดงภาพฮิสโตลอจิกปกติในการตรวจเนื้อเยื่อตามปกติ ขั้นตอนทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมาธิการจริยธรรมแห่งโคโลญจน์และคณะกรรมการจริยธรรมระดับภูมิภาคของสตอกโฮล์ม และดำเนินการตามปฏิญญาเฮลซิงกิ หากมี ผู้ป่วยหรือผู้ปกครองของผู้ป่วยให้ความยินยอมที่ได้รับการบอกกล่าว

โมเดลเมาส์สำหรับ FSGSหนูเมาส์ที่มีการกลายพันธุ์แบบจุดสองจุดของสารประกอบเฮเทอโรไซกัส Pod8asicyAzv ถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้" หนูเมาส์ถูกตัดขาดเมื่ออายุ 20 สัปดาห์ตามที่ระบุไว้ข้างต้นการตรึงมนุษย์กับหนูไตถูกตรึงในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 1 × ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1-3 ชั่วโมง มนุษย์ที่ถูกเนฟเฟกโตไมด์ไตได้รับการแก้ไขในสารละลาย Dubosaq-Brasil เป็นเวลา 3 ชั่วโมงการแบ่งส่วนตัวอย่างถูกฝังในอะกาโรส 3 เปอร์เซ็นต์และแบ่งส่วนความหนา 300 ไมโครเมตรโดยใช้ไวบราโทมDelipidationตัวอย่างถูกบ่มในสารละลายเคลียร์ริ่ง (200 มิลลิโมลาร์ กรดบอริกและ 4 เปอร์เซ็นต์ SDS,pH 8.5) ที่ 70 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมงด้วยการเขย่าเวลา 500 น.การติดฉลากโปรโตคอลการติดฉลากและรายการแอนติบอดี/โพรบมีอยู่ในเอกสารประกอบการติดตั้งตัวอย่างถูกบ่มใน 80 เปอร์เซ็นต์ของฟรุกโตส(1 มล.ของ dH,0 ที่เติมลงในฟรุกโตส 4 กรัม)ที่มียูเรีย 4 โมลาร์ที่37 องศาด้วยการเขย่าที่ 500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 15 นาที แล้ววางลงในจาน MatTek (MatTek , Ashland, MA) พร้อมฝาครอบด้านบน (เพื่อป้องกันการระเหย) ก่อนการถ่ายภาพการถ่ายภาพภาพได้มาโดยใช้ระบบคอนโฟคอล Leica SP8 (วัตถุประสงค์ที่ระบุไว้ในตำนานรูป) (Leica Microsystems, Buffalo Grove,IL) การถ่ายภาพด้วยวัตถุประสงค์ 100× จะหมายถึงการตั้งค่ารูเข็มที่ 03 AU เสมอ (ตามที่คำนวณสำหรับแสง 594-nm) หากไม่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น การถ่ายภาพเนื้อเยื่อวิทยามาตรฐานดำเนินการโดยใช้ระบบ Leica DM3000 (รูปที่ 5) หรือระบบ Olympus BX45 (Olympus, Tokyo, Japan) (รูปที่ 6) immunofluorescence มาตรฐานดำเนินการโดยใช้ Nikon Microphot-FXA (Nikon, Tokyo, Japan) และ EM ดำเนินการด้วย Zeiss 912 (รูปที่ 5) หรือ Hitachi 7700 (Hitachi, Tokyo, Japan) (รูปที่ 6) กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านการประมวลผลและการวิเคราะห์ภาพเว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น รูปภาพจะปรับให้เรียบโดยแทนที่ค่าพิกเซลแต่ละค่าด้วยค่าเฉลี่ยของพื้นที่ใกล้เคียง 3×3 โดยใช้ Fiji/ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) การวิเคราะห์ทางสัณฐานวิทยาได้อธิบายไว้ในวิธีการเสริมและแสดงไว้ในรูปที่ S4