การศึกษาความเป็นพิษกึ่งเรื้อรัง 13- สัปดาห์ของ 2- (แอล-เมนทอกซี) เอทานอลในหนู F344

บทคัดย่อ: 2-(l-Menthoxy)เอธานอลมักถูกใช้เป็นสารแต่งกลิ่นรส อย่างไรก็ตาม ข้อมูลเกี่ยวกับ 2-(l-menthoxy)ความเป็นพิษของเอทานอลยังคงมีจำกัด เราแสดงเป็นเวลา 13- สัปดาห์ความเป็นพิษกึ่งเรื้อรังการศึกษา {{0}}(แอล-เมนทอกซี)เอธานอลในหนู F344 ตัวผู้และตัวเมีย ด้วยขนาดยา 0, 15, 60 หรือ 250 มก./กก. ของน้ำหนักตัว (BW)/วัน บริหารทางปากโดยใช้สายยาง น้ำมันข้าวโพดเป็นพาหนะ ไม่มีการเปลี่ยนแปลงทางพิษวิทยาที่มีนัยสำคัญในสภาวะโดยทั่วไป น้ำหนักตัว หรือการรับประทานอาหารในทุกกลุ่ม การประเมินทางโลหิตวิทยาพบว่าฮีโมโกลบินลดลง,ฮีมาโตคริต, ปริมาตรร่างกายเฉลี่ย และค่าเฉลี่ยฮีโมโกลบินในหลอดเลือดและจำนวนเกล็ดเลือดที่เพิ่มขึ้นในกลุ่มผู้ชาย 250 มก./กก.ชีวเคมีในซีรั่มเปิดเผยคอเลสเตอรอลรวมเพิ่มขึ้นในกลุ่มหนูตัวผู้และตัวเมีย 250 มก./กก. ลดไตรกลีเซอไรด์ในกลุ่มหนูตัวเมีย 250 มก./กก. และเพิ่มโปรตีนรวมในกลุ่มหนูตัวผู้ 250 มก./กก. บ่งชี้ผลต่อการเผาผลาญไขมันและการสังเคราะห์โปรตีน- สำหรับน้ำหนักอวัยวะ น้ำหนักสัมบูรณ์และน้ำหนักสัมพัทธ์ของตับและต่อมหมวกไตเพิ่มขึ้นในกลุ่ม 250 มก./กก. ของทั้งสองเพศ และกลุ่มชาย 250 มก./กก. ตามลำดับ การวิเคราะห์ทางจุลพยาธิวิทยาพบว่าโรคไตเรื้อรังในกลุ่มผู้ชายขนาด 15 มก./กก. หรือสูงกว่า โดยมีน้ำหนักไตสัมพัทธ์สัมบูรณ์และสัมพัทธ์เพิ่มขึ้น รวมถึงระดับครีเอตินีนในเลือดที่เพิ่มขึ้น ในกลุ่มชายขนาด 60 และ 250 มก./กก. อย่างไรก็ตาม มีการระบุเม็ดอีโอซิโนฟิลิกที่มี 2u-globulin ใน tubules ใกล้เคียง ซึ่งบ่งบอกถึงโรคไต 2u-globulin ที่จำเพาะต่อหนูตัวผู้และไม่มีนัยสำคัญทางพิษวิทยา ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าระดับที่ไม่มีผลข้างเคียงที่สังเกตได้ของ 2-(l-methoxy)เอทานอลคือ 60 มก./กก. BW/วัน สำหรับทั้งสองเพศ (DOI: 10.1293/tox.2020-0091; J Toxicol Pathol 2021; 34: 309–317)

คำหลัก: 2-(l-เมนทอกซี)เอทานอล, 2-แอล-เมนทอกซีเอทานอล, วัตถุเจือปนอาหาร, สารแต่งกลิ่น, หนูฟิชเชอร์, เมนทอล

อาหารเสริม Cistanche อาหารเสริมสนับสนุนการทำงานของไต PhGs75% Ech 30% Act 12%

การแนะนำ

{{0}}(l-Menthoxy)เอทานอล (CAS No. 38618-23-4) เป็นของเหลวใสไม่มีสี มีกลิ่นเฉพาะตัว และมีการใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นสารแต่งกลิ่นรส คณะกรรมการผู้เชี่ยวชาญร่วมด้านวัตถุเจือปนอาหารของ FAO/WHO (JECFA) ได้ประเมิน 2-(l-เมนทอกซี)เอธานอล เป็นสารปรุงแต่งรส ซึ่งจัดประเภทเป็นสารที่มีโครงสร้างเกี่ยวข้องกับเมนทอล1 ขึ้นอยู่กับประเภทโครงสร้างของสารแต่งกลิ่น 2-(l-menthoxy)เอทานอลถูกกำหนดให้เป็นประเภท I ในสหรัฐอเมริกาและยุโรป ระดับการบริโภค 2-(l-menthoxy)เอทานอลโดยมนุษย์ คาดว่าจะอยู่ที่ 12 ไมโครกรัม/คน/วัน และ 0.01 ไมโครกรัม/คน/วัน ตามลำดับ ซึ่งทั้งสองค่าต่ำกว่าเกณฑ์ Class I ที่ 1,800 ไมโครกรัม/คน/วัน จากการประมาณการเหล่านี้ ถือว่า 2-(l-menthoxy)เอทานอลอาจไม่มีข้อกังวลด้านความปลอดภัยในระหว่างการใช้เป็นประจำเป็นสารแต่งกลิ่นรส

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(l-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 มก./กก. น้ำหนักตัว [BW])1. แม้ว่าจะใช้ 2-(l-men thoxy)เอทานอลเป็นสารแต่งกลิ่น แต่ก็มีข้อมูลที่จำกัดเกี่ยวกับความเป็นพิษเมื่อได้รับสารซ้ำๆ ของสารประกอบนี้ ห้องปฏิบัติการของเราได้ตรวจสอบความเป็นพิษของวัตถุเจือปนอาหารหลายชนิด รวมถึงสารแต่งกลิ่นที่เป็นตัวแทนจากแต่ละหมวดหมู่ในแบบจำลองสัตว์ฟันแทะ2–7 เพื่อชี้แจงประวัติทางพิษวิทยาและกำหนดระดับที่ไม่มีผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์ (NOAEL) เราได้ทำการศึกษาความเป็นพิษแบบย่อยเรื้อรัง 13- สัปดาห์ของ 2-(l-เมนทอกซี)เอธานอล ซึ่งให้ทางปากเพื่อ F344 หนูโดย Gavage

วัสดุและวิธีการ

ทดสอบสารเคมี

2-(l-Menthoxy)เอทานอล (หมายเลขล็อต 5I0002 ความบริสุทธิ์ 99.9%) ผลิตโดย Takasago Int. Corp. (โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) จัดทำโดยแผนกมาตรฐานและการประเมินผล กรมความปลอดภัยด้านอาหาร กระทรวงสาธารณสุข แรงงาน และสวัสดิการ ประเทศญี่ปุ่น โดยได้รับการสนับสนุนจากสมาคมวัสดุรสชาติและน้ำหอมของญี่ปุ่น (โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) แม้ว่าสารทดสอบจะถูกจัดเตรียมไว้เป็นส่วนผสมของไอโซเมอร์เชิงแสง (CAS No. 38618-23-4) แต่ก็ได้รับการยืนยันว่าเป็น l-enantiomer (CAS No. 75443-64-0) ​​โดยผู้ผลิต การให้อาหารทางปากด้วยน้ำมันข้าวโพด (Wako Pure Chemical Industries, โอซาก้า, ญี่ปุ่น) เป็นพาหะนำได้รับเลือกเป็นเส้นทางการบริหารเนื่องจากความไม่ละลายน้ำและความผันผวนของเอทานอล 2-(l-เมนทอกซี) มีการเตรียมสารละลายของ 2-(l-เมนทอกซี)เอทานอลทุกวันทันทีก่อนการบริหาร หลังจากเก็บรักษาเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง อัตราส่วนคงเหลือของเอทานอล 2-(l-เมนทอกซี) ในสารละลาย 4, 40 และ 400 มก./มล. ได้รับการยืนยันเป็น 96.8%, 99.8% และ 96.5% ตามลำดับ โดยแก๊สโครมาโทกราฟี (สมาคมตรวจสอบสิ่งแวดล้อมอาหารและอุตสาหกรรมอาหารแห่งประเทศญี่ปุ่น โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น)

สัตว์ทดลอง

โดยรวมแล้ว หนูปลอดเชื้อโรคตัวผู้ 40 ตัวและตัวเมีย 40 ตัว (F344/DuCrlCrlj อายุ 5- สัปดาห์) ถูกซื้อจาก Charles River Laboratories Japan (โยโกฮามา ญี่ปุ่น) และใช้หลังจากปรับตัวให้ชินกับสภาพแวดล้อมเป็นเวลาหนึ่งสัปดาห์ ในระหว่างการศึกษา สัตว์ถูกเลี้ยงไว้ในกรงโพลีคาร์บอเนตที่มีแผ่นปูรองแบบนุ่ม ได้รับการดูแลในห้องที่มีระบบกั้นเพื่อควบคุมวงจรแสง/ความมืด (12 ชั่วโมง) การระบายอากาศ (อัตราการแลกเปลี่ยนอากาศ 18 ครั้ง/ชั่วโมง) อุณหภูมิ ( 24 ± 1 องศา ) และความชื้นสัมพัทธ์ (55 ± 5%) มีการเปลี่ยนกรงและผ้าปูที่นอนชิปสัปดาห์ละสองครั้ง สัตว์แต่ละตัวสามารถเข้าถึงน้ำประปาและอาหารพื้นฐานได้ฟรี (CRF-1; Oriental Yeast, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ในช่วงเริ่มต้นของการทดลอง สัตว์ต่างๆ ได้รับการสุ่มแบ่งออกเป็นสี่กลุ่ม กลุ่มละ 10 หนูตัวผู้และตัวเมียแต่ละตัว โดยพิจารณาจากน้ำหนักตัวที่วัดทันทีก่อนที่จะเริ่มการรักษาด้วยสารเคมีทดสอบ

เรียนออกแบบ

ในการศึกษาเบื้องต้น {{0}} วัน โดยประเมินเอทานอล 2-(แอล-เมนทอกซี) ที่ปริมาณ 0, 200, 400 และ 800 มก./กก. BW/วัน แบบสัมบูรณ์ และน้ำหนักตับสัมพัทธ์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในทุกกลุ่มที่ได้รับการรักษาทั้งสองเพศ (ไม่แสดงข้อมูล) จากผลลัพธ์เหล่านี้ เราเลือกขนาดเอธานอล 2-(แอล-เมนทอกซี) ที่ 0, 15, 60 และ 250 มก./กก. น้ำหนักตัว/วัน สำหรับการบริหารให้กับหนูทั้งตัวผู้และตัวเมียในปัจจุบัน 13- การศึกษาความเป็นพิษประจำสัปดาห์

มีการประเมินสภาพทั่วไปและการเสียชีวิตทุกวัน น้ำหนักตัว รวมถึงปริมาณอาหารที่ให้และอาหารที่เหลือถูกวัดสัปดาห์ละครั้งในระหว่างช่วงการทดลอง หนูทุกตัวอดอาหารข้ามคืนเมื่อเสร็จสิ้นการรักษา และเก็บตัวอย่างเลือดสำหรับโลหิตวิทยาและชีวเคมีในซีรัมจากเอออร์ตาในช่องท้องภายใต้การดมยาสลบสูดดมลึกโดยใช้ไอโซฟลูเรน การออกแบบการศึกษานี้เป็นไปตามแนวทางการกำหนดวัตถุเจือปนอาหารและการแก้ไขมาตรฐานการใช้วัตถุเจือปนอาหารของญี่ปุ่น (1996) และได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของสถาบันวิทยาศาสตร์สุขภาพแห่งชาติ ประเทศญี่ปุ่น

โลหิตวิทยาและชีวเคมีในซีรั่ม

พารามิเตอร์ทางโลหิตวิทยาต่อไปนี้ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้เครื่องวิเคราะห์โลหิตวิทยาอัตโนมัติ ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA): จำนวนเม็ดเลือดขาว (WBC), จำนวนเม็ดเลือดแดง (RBC), ความเข้มข้นของฮีโมโกลบิน (HGB), ฮีมาโตคริต (HCT) ปริมาตรร่างกายเฉลี่ย (MCV), ค่าเฉลี่ยของฮีโมโกลบินในหลอดเลือด (MCH), ความเข้มข้นของฮีโมโกลบินในหลอดเลือดเฉลี่ย (MCHC), จำนวนเกล็ดเลือด (PLT) และเซลล์เม็ดโลหิตขาวส่วนต่าง รวมถึงนิวโทรฟิล (Neut), เซลล์เม็ดเลือดขาว (น้ำเหลือง), โมโนไซต์ (โมโน), อีโอซิโนฟิล (อีโอซิโน) และเบโซฟิล (บาโซ) การวิเคราะห์ทางชีวเคมีในซีรั่มดำเนินการโดย Oriental Yeast สำหรับพารามิเตอร์ต่อไปนี้: โปรตีนทั้งหมด (TP), อัลบูมิน (Alb), อัตราส่วนอัลบูมิน/โกลบูลิน (A/G), บิลิรูบินทั้งหมด (Bil), กลูโคส, โคเลสเตอรอลทั้งหมด (T-Chol) ไตรกลีเซอไรด์ (TG), ยูเรียไนโตรเจน (BUN), ครีเอตินีน (Cre), แคลเซียม (Ca), ฟอสฟอรัสอนินทรีย์ (IP), โซเดียม (Na), โพแทสเซียม (K), คลอรีน (Cl), แอสพาเทตอะมิโนทรานสเฟอเรส (AST), อะลานีน อะมิโนทรานสเฟอเรส (ALT), อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (ALP) และ -กลูตามิลทรานส์เปปทิเดส ( -GTP)

น้ำหนักอวัยวะและการประเมินทางจุลพยาธิวิทยา

สัตว์ทุกตัวทำการตัดชันสูตรอย่างสมบูรณ์ และชั่งน้ำหนักสมอง ไทมัส ปอด หัวใจ ม้าม ตับ ต่อมหมวกไต ไต อัณฑะ และรังไข่ อวัยวะเหล่านี้ตลอดจนเนื้อเยื่อจากไขสันหลัง เส้นประสาทไตรเจมินัล ต่อมใต้สมอง โพรงจมูก ต่อมน้ำลาย ลิ้น หลอดอาหาร หลอดลม เอออร์ตา ต่อมไทรอยด์ ต่อมพาราไธรอยด์ ตับอ่อน กระเพาะอาหาร ลำไส้เล็กและลำไส้ใหญ่ ใต้ขากรรไกรล่าง และลำไส้เล็กส่วนต้น ต่อมน้ำเหลือง ช่องคลอด มดลูก กระเพาะปัสสาวะ ต่อมลูกหมาก ถุงน้ำเชื้อ ท่อน้ำอสุจิ กระดูกโคนขาและกระดูกสันอกที่มีไขกระดูก กระดูกสันหลัง กล้ามเนื้อโครงร่าง เส้นประสาทไซอาติก ผิวหนัง และต่อมน้ำนม ได้รับการแก้ไขในฟอร์มาลินบัฟเฟอร์ที่เป็นกลาง 10% จากนั้นเตรียมส่วนที่ฝังพาราฟินและย้อมด้วยฮีมาทอกซิลินและอีโอซินเพื่อตรวจทางจุลพยาธิวิทยา อัณฑะและดวงตาที่มีต่อม Harderian ได้รับการแก้ไขในสารละลาย Bouin's Fixative และสารละลายของ Davidson ตามลำดับ เนื้อเยื่อกระดูก ซึ่งรวมถึงโพรงจมูก กระดูกสันหลัง กระดูกสันอก และกระดูกโคนขา ถูกทำให้เป็นรูปลอกโดยใช้ส่วนผสมของกรดฟอร์มิก 10% และฟอร์มาลินบัฟเฟอร์ 10% เป็นเวลาสูงสุด 2 สัปดาห์ การประเมินทางจุลพยาธิวิทยาถูกดำเนินการสำหรับเนื้อเยื่อทั้งหมดที่ได้รับจากสัตว์ในกลุ่มควบคุมและกลุ่มที่ได้รับยาในขนาดสูงสุด เว้นแต่จะสังเกตเห็นรอยโรคที่เกี่ยวข้องกับการรักษาใดๆ

อิมมูโนฮิสโตเคมีสำหรับ 2u-globulin

ในหนูตัวผู้ ตรวจสอบการสะสมของ 2u-globulin ในไตโดยการวิเคราะห์ทางอิมมูโนฮิสโตเคมีของส่วนที่ฝังพาราฟิน สำหรับการดึงแอนติเจน ส่วนที่ได้รับจากหนู 5 ตัวในแต่ละกลุ่มจะถูกบ่มด้วยโปรตีเอส K (DAKO, Glostrup, เดนมาร์ก) เป็นเวลา 1 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ทุกส่วนถูกแช่ในสารละลาย 3% H2O2/เมทานอลเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้องเพื่อหยุดการทำงานของเปอร์ออกซิเดสภายนอก หลังจากปิดกั้นปฏิกิริยาที่ไม่เฉพาะเจาะจงด้วยซีรั่มกระต่ายปกติ 10% ส่วนต่างๆ จะถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิสำหรับ 2u-globulin (เจือจาง 1:400; แอนติบอดีต่อต้านหนู 2u-globulin; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) ข้ามคืนที่ 4 องศา 8. การแสดงการจับแอนติบอดีทำได้โดยใช้ Vecta Stain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) และ 3,3′-diaminobenzidine ทุกส่วนถูกขัดขวางด้วยฮีมาทอกซิลิน

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ความแปรปรวนในค่าข้อมูลสำหรับน้ำหนักตัวในระหว่างช่วงการทดลอง เช่นเดียวกับค่าทางโลหิตวิทยา ชีวเคมีในซีรั่ม และน้ำหนักอวัยวะ ได้รับการประเมินความเป็นเนื้อเดียวกันโดยใช้การทดสอบของ Bartlett การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวและการทดสอบครัสคัล-วาลลิส ตามลำดับถูกนำมาใช้สำหรับข้อมูลที่เป็นเนื้อเดียวกันและต่างกัน ในการพิจารณาความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติ มีการใช้การทดสอบเปรียบเทียบหลายรายการของ Dunnett เพื่อเปรียบเทียบกลุ่มควบคุมและกลุ่มการรักษา การเปรียบเทียบอุบัติการณ์และเกรดทางจุลพยาธิวิทยาได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การทดสอบความน่าจะเป็นที่แน่นอนของฟิชเชอร์และการทดสอบ U ของแมนน์-วิทนีย์ ตามลำดับ ค่า P ของ<0.05 were considered statistically significant.