3-ตัวรับอะดรีเนอร์จิกบนเซลล์เม็ดเลือดขาวที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอกจะรักษาการแสดงออกของ PD-L1 ที่ขึ้นอยู่กับ IFN- - และทำให้ภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอกในนิวโรบลาสโตมาลดลง
Oct 19, 2023
Neuroblastoma (NB) เป็นเนื้องอกนอกกะโหลกศีรษะที่แตกต่างกันซึ่งเกิดขึ้นในวัยเด็ก คุณลักษณะที่โดดเด่นของเนื้องอก NB คือความสามารถของระบบประสาทต่อมไร้ท่อในการหลั่ง catecholamines ซึ่งในทางกลับกันผ่าน ligation ของตัวรับ adrenergic อาจส่งผลต่อเส้นทางการส่งสัญญาณที่แตกต่างกันในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก (TME) ก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นแล้วว่าการต่อต้านกันเฉพาะของ 3-ตัวรับอะดรีเนอร์จิก ( 3- AR) บนเซลล์เนื้องอก NB ส่งผลต่อการเติบโตและการลุกลามของเนื้องอก ในที่นี้ ในแบบจำลองซินจีนิกของหนู NB เรามุ่งเป้าที่จะตรวจสอบว่าการปรับ 3- AR มีอิทธิพลต่อการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์ต่อเนื้องอกหรือไม่ ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า 3-การต้าน AR นำไปสู่การกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันอีกครั้ง ซึ่งบางส่วนขึ้นอยู่กับการมีส่วนร่วมของแกนส่งสัญญาณ PD-1/PD-L1 โดยแท้จริงแล้ว 3- การปิดล้อม AR บนลิมโฟไซต์ที่แทรกซึมของเนื้องอก (TIL) ทำให้ความสามารถของพวกมันในการหลั่ง IFN- ลดลง ซึ่งในทางกลับกันจะลดการแสดงออกของ PD-L1 ที่เกิดจากการแทรกซึมของ TIL บนเซลล์เนื้องอก NB การตรวจสอบเพิ่มเติมผ่านการวิเคราะห์จีโนมในผู้ป่วย NB แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของยีน ADRB3 ที่สูงมีความสัมพันธ์กับผลลัพธ์ทางคลินิกที่แย่ลงเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่มีการแสดงออกต่ำ และการแสดงออกของยีน ADRB3 ส่งผลต่อวิถีทางที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันที่แตกต่างกัน โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์บ่งชี้ว่า 3-AR ใน NB TME สามารถปรับปฏิสัมพันธ์ระหว่างเนื้องอกและระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์ได้ และการต่อต้านของมันจะกระทบกับวิถีการส่งสัญญาณที่ทำให้เกิดเนื้องอกหลายเส้นทาง
บทคัดย่อกราฟิก
การแนะนำ
Neuroblastoma (NB) เป็นโรคที่ซับซ้อนและต่างกัน และเป็นมะเร็งชนิดที่พบบ่อยที่สุดที่ได้รับการวินิจฉัยในปีแรกของชีวิต NB คือเนื้องอกในระบบประสาทต่อมไร้ท่อที่เกิดจากเซลล์ต้นกำเนิดที่มุ่งมั่นของยอดประสาทในระหว่างการพัฒนาระบบประสาทซิมพาเทติก (SNS) ต้นกำเนิดที่โดดเด่นนี้กำหนดตำแหน่งของเนื้องอก ซึ่งมักเกิดขึ้นในต่อมหมวกไตและ/หรือปมประสาทที่เห็นอกเห็นใจ [1] พฤติกรรมทางคลินิกของ NB มีความแปรปรวนสูง ตั้งแต่เนื้องอกที่ถอยกลับเองตามธรรมชาติ ไปจนถึงเนื้องอกอื่นๆ ที่ดื้อต่อการรักษาที่มีอยู่ทั้งหมด รวมถึงเคมีบำบัดแบบเข้มข้น การผ่าตัด การฉายรังสี การปลูกถ่ายเซลล์ต้นกำเนิดด้วยตนเอง และการให้เรตินอยด์ (13-ซิส-เรติโนอิก) กรด) [2]. ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีเป้าหมายการรักษาทางเลือกสำหรับเนื้องอกที่ไม่ตอบสนองเหล่านี้ การบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันโดยใช้สารยับยั้งจุดตรวจภูมิคุ้มกัน (ICIs) แสดงถึงกลยุทธ์ที่มีแนวโน้มมากที่สุดสำหรับเนื้องอกที่เป็นก้อนหลายชนิด [3] ท่ามกลางสิ่งอื่นๆ แกนการส่งสัญญาณลิแกนด์การตายที่ตั้งโปรแกรมไว้-1/การตายที่ตั้งโปรแกรมไว้-1 (PD-L1/PD-1) ทำให้ภูมิคุ้มกันของเอฟเฟกเตอร์ทีเซลล์ลดลงและเพิ่มความทนทานต่อภูมิคุ้มกันของเซลล์เนื้องอก ซึ่งมีบทบาทสำคัญ บทบาทในการลดการตอบสนองต่อการต่อต้านเนื้องอกในมะเร็งทั้งหนูและมะเร็งในมนุษย์ [4, 5] อย่างไรก็ตาม แม้ว่าการศึกษาจำนวนมากได้ตรวจสอบกลไกที่เกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณ PD-1/PD-L1 ในมะเร็งผู้ใหญ่แล้ว แต่ยังไม่ค่อยมีใครทราบเกี่ยวกับเนื้องอกในเด็ก การพูดคุยข้ามที่ซับซ้อนระหว่าง SNS และระบบภูมิคุ้มกัน ผ่านการปลดปล่อย catecholamine และการกระตุ้นการส่งสัญญาณของตัวรับ -adrenergic สามารถระบุชะตากรรมของการลุกลามของเนื้องอกในเนื้องอกจำนวนมากได้ [6] สิ่งนี้อาจเป็นจริงโดยเฉพาะอย่างยิ่งในผู้ป่วย NB ซึ่งแท้จริงแล้วระดับ catecholamines ที่เพิ่มขึ้นสะท้อนถึงความรุนแรงของมะเร็ง [7] ชนิดย่อย 3-adrenergic receptor ( 3-AR) ได้รับการระบุว่าเป็นตัวควบคุมที่สำคัญของมะเร็ง [8–10] โดยเฉพาะอย่างยิ่งการแสดงออกและการกระตุ้นของมันทั้งในเนื้องอกและเซลล์สโตรมัลของสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก (TME) ทำให้เกิดเส้นทางการส่งสัญญาณของเนื้องอกที่รับผิดชอบต่อการลุกลามของเนื้องอกในแบบจำลองก่อนคลินิกที่แตกต่างกัน [11–14] ในที่นี้ ในแบบจำลองหนูสังเคราะห์ของ NB เราแสดงให้เห็นว่า 3-AR บนลิมโฟไซต์ที่แทรกซึมของเนื้องอก (TIL) คงไว้ซึ่งการควบคุม PD-L1 ที่ขึ้นกับ IFN- - บนเซลล์เนื้องอก ซึ่งในทางกลับกันนำไปสู่ TME ที่กดภูมิคุ้มกันซึ่งรับผิดชอบในการหลบหนีของเนื้องอก นอกจากนี้ 3-การต่อต้าน AR ยังสามารถเพิ่มจำนวน CD ที่ทำปฏิกิริยากับภูมิคุ้มกันได้8+, Natural Killer (NK) และเซลล์เดนไดรต์ (DCs) และเพื่อลดจำนวนของกฎระเบียบในการกดภูมิคุ้มกัน ทีเซลล์ (Treg) และเซลล์กดรับที่ได้มาจากไมอีลอยด์ (MDSC) ใน TME นอกจากนี้ การวิเคราะห์ของ Kaplan – Meier แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของยีน ADRB3 ที่สูงมีความสัมพันธ์กับอัตราการรอดชีวิตที่ไม่ดีของผู้ป่วย NB และการวิเคราะห์ชุดข้อมูลสาธารณะที่แตกต่างกันของการแสดงออกของ NB เผยให้เห็นความสัมพันธ์ที่สำคัญระหว่างระดับการแสดงออกของยีน ADRB3 และยีนที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้องกับ ปฏิสัมพันธ์ของระบบภูมิคุ้มกัน/เนื้องอก
ประโยชน์ของ cistanche tubulosa-Antitumor
วิธีการ
การเพาะเลี้ยงเซลล์
Neuro-2เซลล์มะเร็ง NB ของหนูได้รับจาก ATCC (CCL-131) และเติบโตใน DMEM เสริมด้วย FBS 10%, L-กลูตามีน 2 มิลลิโมลาร์, 100 U·ml−1 เพนิซิลลิน และ 100 ug·ml−1 สเตรปโตมัยซินที่ 37 องศาในบรรยากาศอิ่มตัวของน้ำ และมี CO2 5% เซลล์นิวโร-2ได้รับการทดสอบเป็นประจำสำหรับการปนเปื้อนของไมโคพลาสมา
แบบจำลองหนูซินเจนิกของเนื้องอก
หนู NCI A/JCr ตัวเมียอายุ 4 สัปดาห์ถูกซื้อจาก Charles River Laboratories (Frederick) เซลล์ประสาท-2เซลล์ (N2A) ถูกปลูกฝังใต้ผิวหนังในหนูผู้รับ A/J โดยการฉีด 1 × 106 เซลล์ใน 100 ไมโครลิตรของ PBS ที่ปีกด้านขวา เมื่อเซลล์ N2A ก่อตัวเป็นเนื้องอกที่เห็นได้ชัดเจน (ประมาณ 8 วัน) การรักษาก็เริ่มต้นขึ้น การบำบัดถูกบริหารให้วันละสองครั้งสำหรับ SR59230A (โทคริส ไบโอไซเอนซ์) และกระสายยา (สารละลายทางสรีรวิทยา) และในวันที่ 8 และวันที่ 12 สำหรับแอนติบอดี PD-L1 (InVivoMAb ต้านหนูเมาส์ PD-L1 (B7-xhH1) #BE0101 , Bio X Cell) และการควบคุมไอโซไทป์ (การควบคุมไอโซไทป์ IgG2b ของหนู InVivoMAb # BE0090, Bio X Cell) การบริหารให้ควบคุมไอโซไทป์ของ IgG2b ให้ผลลัพธ์ที่เหมือนกันของกระสายยา ดังนั้นเฉพาะสภาพของกระสายยาเท่านั้นที่ถูกแสดงไว้ในรูปภาพ SR59230A ถูกส่งมอบที่ 10 มก./กก. ในสารละลายทางสรีรวิทยาผ่านทางเยื่อบุช่องท้อง (ip); PD-L1 250 ไมโครกรัมถูกนำส่ง ip ในบัฟเฟอร์การเจือจาง InVivoPure™ pH 6.5 100 ไมโครกรัม (#IP0065); หนูควบคุมไอโซไทป์ IgG2b 250 ไมโครกรัมถูกนำส่ง ip ใน 100 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์การเจือจาง InVivoPure™ pH 7.0 (#IP0070) การบำบัดด้วย FTY720 (#6176, Tocris Biotechne) ถูกบริหารให้ที่ 2 มก./กก. ต่อระบบปฏิบัติการ (po) ตั้งแต่วันที่ 6 อัตราการเติบโตของเนื้องอกได้รับการประเมินโดยการวัดมวลเนื้องอกด้วยลำกล้อง และปริมาตรมวลเนื้องอกถูกคำนวณเป็นปริมาตร {{ 41}} [(ยาว × กว้าง)2 /2] หนูถูกสังเวยหลังการรักษา 8 วัน
การวิเคราะห์แบบตะวันตก
เซลล์ถูกรวบรวมและแยกส่วนในบัฟเฟอร์ RIPA ที่มีค็อกเทลตัวยับยั้งโปรตีเอส หลังการหาปริมาณ โปรตีนทั้งหมด 20 ไมโครกรัมถูกใช้เพื่อทำการวิเคราะห์ SDS-PAGE และ WB เมมเบรน PVDF ถูกบ่มในชั่วข้ามคืนด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ anti-PD-L1 (ab238697, Abcam), ฟอสโฟ-CREB (ab32096, Abcam), CREB (ab32515, Abcam), p-PKA / / (sc- 32968, Santa เทคโนโลยีชีวภาพของครูซ), -actin (sc-1615, เทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซ), 3-AR (ab94506, Abcam) ที่ 4 องศา จากนั้นด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิจำเพาะเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ตรวจพบการจับกันของแอนติบอดีกับโปรตีนจำเพาะโดยใช้ Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad) และได้ภาพผ่าน Chemidoc Imaging System (Biorad®) ซอฟต์แวร์ ImageJ ถูกใช้เพื่อทำการวิเคราะห์เชิงปริมาณ และความเข้มของสัญญาณของแถบความถี่ถูกแสดงเป็นการเพิ่มขึ้นแบบพับเมื่อเทียบกับค่าควบคุม
การเพาะเลี้ยงร่วมสำหรับการสอบวิเคราะห์ไซโตฟลูออริเมทริก PD-L1
เซลล์เนื้องอกถูกเพาะบน MW24 (45,000 เซลล์/หลุม) และหลังจาก 24 ชั่วโมงถูกเพาะเลี้ยงร่วมกับลิมโฟไซต์ที่ได้มาจาก TDLN ของหนูที่ได้รับการบำบัดล่วงหน้าเป็นเวลา 2 วันด้วยกระสายยาหรือ SR59230A (T2) ใน อัตราส่วนการเพาะ 1:10 (เนื้องอก/ลิมโฟไซต์) เมื่อสิ้นสุดระยะฟักตัวทั้งหมด (48 ชั่วโมง) ลิมโฟไซต์ถูกถอนออกร่วมกับตัวกลางของการเพาะเลี้ยงร่วมโดยการปิเปตอย่างอ่อนโยน และจากนั้นเซลล์เนื้องอกก็ถูกแยกออกโดยทริปซิไนเซชันและทำเครื่องหมายด้วยแอนติ-PD-L1 แอนติบอดี (CD274 แอนติบอดี { {17}}, eBioscience™) สำหรับการหาปริมาณไซโตฟลูออริเมทริก เซลล์ที่เปื้อนได้มาจากเครื่องวิเคราะห์ MACSQuant 10 Flow Cytometer (Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany) และข้อมูลได้รับการประมวลผลโดยใช้ซอฟต์แวร์ Flowlogic (Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)
การเพาะเลี้ยงร่วมสำหรับอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ PD-L1 และปริมาณ IFN
เซลล์เนื้องอกถูกเพาะบนกล้องจุลทรรศน์สไลด์ (20,000 เซลล์/หลุม) ในห้อง Nunc Lab-Tek สไลด์ 4 และหลังจาก 24 ชั่วโมงถูกเพาะเลี้ยงร่วมกับลิมโฟไซต์ที่ได้รับจาก TDLN ของหนูที่บำบัดเป็นเวลา 2 วันด้วยกระสายยา หรือ SR59230A (T2) ในอัตราส่วนการเพาะที่ 1:10 (เนื้องอก/ลิมโฟไซต์) หลังจากผ่านไป 48 ชั่วโมง ลิมโฟไซต์ในอาหารเลี้ยงเชื้อจะถูกรวบรวมโดยการปิเปตอย่างอ่อนโยน จากนั้นจึงทิ้งโดยการปั่นแยก ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกใช้เพื่อหาปริมาณ IFN- ผ่านทางเทคโนโลยี Luminex xMAP ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยสรุป การหาปริมาณ IFN ในอาหารเลี้ยงเชื้อร่วมดำเนินการโดยใช้ Bio-Plex Pro Mouse Cytokine IFN- Set (# 171G5017M, Bio-Rad) และข้อมูลได้รับจากระบบ MAGPIX (Luminex, Texas, USA) การวิเคราะห์ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Bio-Plex Manager ™ (BIO-RAD, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) เซลล์เนื้องอกบนสไลด์กล้องจุลทรรศน์ถูกนำมาใช้แทนเพื่อทำการทดสอบอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ PDL1 ดังต่อไปนี้ สำหรับการวิเคราะห์อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ เซลล์ได้รับการแก้ไขในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 3% ใน PBS เป็นเวลา 20 นาที การซึมผ่านได้ได้มาโดยการเติมสารละลายที่มีทวีน-20 0.5% ใน PBS เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นเซลล์ถูกขัดขวางใน 3% BSA เป็นเวลา 1 ชั่วโมงและบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิแอนติ-PD-L1 (ab238697, Abcam) เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ต่อจากนั้น หลังจากล้างใน PBS แล้ว สไลด์จะถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิของ Alexa-fluor 488 เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ได้รับภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ (ไมโครซิสเต็มไลก้า DMi8 -)
สมุนไพรจีน cistanche plant-Antitumor
อิเล็กโตรโพเรชันของ siRNA ของเซลล์เม็ดเลือดขาวสำหรับ 1- 2- และ 3- การปิดเสียง AR
ลิมโฟไซต์ที่ได้รับจาก TDLN ถูกทรานส์เฟกด้วย siRNA สำหรับการคัดเลือก 1- (SASI_Mm01_00090154, ลำดับ: GUGAUCGUGGCCAUCGCCA, Merck), 2- (SASI_Mm{ {5}} ลำดับ: CCAAGUUCGAGCGACUACA, Merck) และ 3-AR (SASI_Mm01_00145466 ลำดับ: CAGUGGACGUGCUCUGUGU, Merck) การปิดเสียง โดยสรุป ลิมโฟไซต์ถูกอิเล็กโตรโพเรตด้วย siRNA (100 นาโนโมลาร์) โดยใช้หน่วย 4D-Nucleofector X (Lonza) และชุด P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X (V4XP-3024, Lonza) โปรแกรม DN-100 เฉพาะสำหรับการแยกอิเล็กโตรโพเรชันของทีเซลล์ของหนูถูกดำเนินการ หลังจากการใช้ไฟฟ้า เซลล์เม็ดเลือดขาวจะถูกเพาะเลี้ยงใน TexMACS Medium (130-097-196, Miltenyi Biotec) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์เนื้องอก N2A เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า สำหรับการหาปริมาณ PD-L1 -ประสิทธิภาพการเงียบของ ARs ในลิมโฟไซต์ได้รับการประเมินผ่าน PCR แบบหยดดิจิทัลดังนี้
PCR แบบหยดดิจิทัลสำหรับการหาปริมาณ -ARs mRNA
RNA ถูกถอดรหัสแบบย้อนกลับโดยใช้ชุดการสังเคราะห์ cDNA ขั้นสูงของ iScript (Bio-Rad) ddPCR ดำเนินการโดยใช้ ddPCR Supermix สำหรับโพรบ (ไม่มี dUTP) (Bio-Rad) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต บนระบบ QX200 (Bio-Rad) และ C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) การทดสอบที่ใช้คือ: Adrb3-FAM (dMmuCPE5088688), Adrb2-FAM (dMmuCPE5089938), Adrb1-FAM (dMmuCPE5100184), Rps18-HEX (dMmuCPE5196447) ข้อมูล ddPCR ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ QuantaSoft™ (เวอร์ชัน 1.7.4, Bio-Rad)
การจัดลำดับ RNA
เนื้องอกที่ตัดออกถูกวางไว้ในบัฟเฟอร์ RLT (Qiagen) และทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยเครื่องจักรด้วย MACS Octo Dissociator ที่อ่อนโยน (Miltenyi Biotec, Glad bach, Germany) โดยใช้หลอด MACS M ที่อ่อนโยน (Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany) ทำการสกัด RNA ทั้งหมดด้วยชุด RNeasy Plus Mini (Qiagen) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การหาปริมาณ RNA ดำเนินการโดยใช้ทั้งเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ NanoDrop 2000/2000c (เทอร์โมฟิชเชอร์) และ Qubit RNA ความไวแสงสูง (HS) (เทอร์โมฟิชเชอร์) ประเมินความสมบูรณ์ของ RNA โดยใช้ Agilent RNA 6000 Pico Kit บน Agilent Bioanalyzer และไม่รวมตัวอย่างทั้งหมดที่มีหมายเลขความสมบูรณ์ของ RNA (RIN) ต่ำกว่า 6.00 การเตรียมห้องสมุดดำเนินการโดยใช้ TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold Kit (Illumina) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยมีอินพุตเริ่มต้น 500 ng ของ RNA ทั้งหมด ประเมินคุณภาพของห้องสมุดโดยใช้ชุด Agilent DNA 7500 บนเครื่องวิเคราะห์ทางชีวภาพของ Agilent ตามด้วยการหาปริมาณของห้องสมุดโดยใช้ 1X dsDNA High Sensitivity (HS) (ThermoFisher) ห้องสมุดถูกจัดลำดับบน NextSeq 550 Sequencing System (Illumina) โดยใช้ NextSeq 500/550 v2.5 (150 รอบ) ชุดรีเอเจนต์เอาต์พุตสูง (Illumina) ดำเนินการรันด้วยการกำหนดค่า 2 × 76 bp
การวิเคราะห์ปริมาณ mRNA และทรานสคริปโตมิกส์
แซลมอน (ข้อ 1.5.1) ในโหมดอิงการทำแผนที่ถูกนำมาใช้เพื่อดำเนินการหาปริมาณของทรานสคริปต์ และทรานสคริปต์อ้างอิงของ mus musculus GRCm38.98 ไฟล์ qf ที่ได้ผลลัพธ์ได้รับการวิเคราะห์โดยภาษาทางสถิติ R แพ็คเกจ tximport ถูกใช้เพื่อนำเข้าข้อมูลใน R และการถอดเสียงถูกยุบลงบนยีนโดยแพ็คเกจ AnnotationDbi และฐานข้อมูล org.Mm.eg.db สุดท้าย เราทำการวิเคราะห์ทางสถิติด้วย DESeq2 เราทำการวิเคราะห์การเพิ่มปริมาณมากเกินไป (ORA) โดยใช้แพ็คเกจ ClusterProfiler เพื่อสืบค้นฐานข้อมูล GO: BP พร้อมด้วยการวิเคราะห์ทางสถิติที่เป็นผลลัพธ์ เพื่อตรวจจับเส้นทางของเซลล์ที่เปลี่ยนแปลง ในการเลือกยีนสำหรับการวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่า เราได้ตั้งค่าเกณฑ์ log2FC เป็น 0.5 (| log2FC|⋝ 0.5) และค่า p-value ที่ปรับเป็น 0.{ {17}}5. หลังจากกรองผลลัพธ์ด้วยค่า p-value 0.05 เราได้ดึงข้อมูลกระบวนการที่ได้รับการควบคุมทางสถิติ 45 กระบวนการใน 15158 ที่ทดสอบกับฐานข้อมูล GO: BP
การหาปริมาณไซโตไคน์ของ Luminex
cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน
คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity
【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
หนูถูกสังเวยหลังจาก 2 วันของการบำบัด (T2) ด้วยกระสายยา, SR59230A, PD-L1 และ SR59230A + PD-L1 และมวลเนื้องอกถูกตัดออกด้วยกรรไกรและทำให้เป็นเนื้อเดียวกันโดยใช้ชุดสลายเซลล์ Bio-Plex (BIO-RAD, แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา) และ MACS Octo Dissociator ที่อ่อนโยน (Miltenyi Biotec ประเทศเยอรมนี) จากนั้น ไลซีนของเนื้องอกจะถูกทดสอบหาความเข้มข้นของไซโตไคน์โดยการตรวจ Bio-Plex Pro™ (BIO-RAD, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ที่ใช้เทคโนโลยี Luminex xMAP ระดับ IFN- , TNF- , IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IL-1 และ IL-1 (pg/ml ) วัดตามคำแนะนำของผู้ผลิต ข้อมูลได้รับจากระบบ MAGPIX (Luminex, Texas, USA) และการวิเคราะห์ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Bio-Plex Manager™ (BIO-RAD, California, USA)
การวิเคราะห์โฟลว์ไซโตเมทริก
การวิเคราะห์โฟลไซโตเมทรีดำเนินการกับเซลล์เนื้องอกและประชากรย่อยของเซลล์ภูมิคุ้มกันของสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกดังต่อไปนี้ โดยสรุป เนื้องอกถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยชุดเมาส์สำหรับการแยกตัวของเนื้องอก (#130-096-730, มิลเทนยี ไบโอเทค) และลิมโฟไซต์ที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอกถูกแยกออกจากเซลล์แขวนลอยทั้งหมดโดยใช้เมาส์ไมโครบีดส์ CD45 (TIL) (#130-110- 618 Miltenyi Biotec) หรือ CD8 (TIL) MicroBeads mouse (#130-116-478, Miltenyi Biotec) ผ่านเครื่องแยก Pro อัตโนมัติ (Miltenyi Biotec) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต จากนั้นเซลล์จะถูกบ่มและย้อมด้วยแอนติบอดีคอนจูเกตฟลูออโรโครมที่แตกต่างกันที่เจือจางอย่างเหมาะสม (ตารางที่ 1 เพิ่มเติม) เซลล์ที่เปื้อนถูกวิเคราะห์โดยใช้เครื่องวิเคราะห์ MACSQuant 10 Flow Cytometer (Miltenyi Biotec®) และข้อมูลถูกประมวลผลโดยใช้ซอฟต์แวร์ Flowlogic (Miltenyi Biotec®)
อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ของเซลล์และเนื้อเยื่อ
การวิเคราะห์อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ของมวลเนื้องอกของ murine ได้ดำเนินการดังนี้ ตัวอย่างถูกตัดออกอย่างรวดเร็ว ตรึงไว้ในฟอร์มาลดีไฮด์ 4% ที่ถูกบัฟเฟอร์เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และฝังพาราฟิน ส่วนเนื้อเยื่อวิทยาที่มีความหนา 5 ไมโครเมตร ถูกตัดออกจากตัวอย่าง ถูกกำจัดพาราฟินและต้มเป็นเวลา 10 นาทีในบัฟเฟอร์โซเดียมซิเตรต (10 มิลลิโมลาร์, pH 6.0; Bio-Optica) สำหรับการดึงแอนติเจนกลับคืนมาและย้อมภูมิคุ้มกันข้ามคืนที่ 4 องศาด้วยปฐมภูมิ แอนติบอดี (แอนติ-PD-L1, ab238697, Abcam; ต่อต้าน- 3-AR, ab94506, Abcam; anti-CD4, 14-9766-82, eBioscience; anti-CD8, 14-0808-82, eBioscience; DBH, ab209487, แอ๊บแคม) ปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันถูกเปิดเผยในส่วนการฟักตัวด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ Alexa Fluor 488- คอนจูเกต IgG หรือ Alexa Fluor 594-คอนจูเกต IgG (1:350; Jackson Laboratory) หลังจากการตอบโต้ด้วย 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ภาพตัวแทนจะได้รับจากกล้องจุลทรรศน์ Olympus BX63 ควบคู่กับซอฟต์แวร์ CellSens Dimension Imaging เวอร์ชัน 1.6 (Olympus) การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ได้รับการประเมินผ่านซอฟต์แวร์ ImageJ (NIH, USA) เนื่องจากความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ของโปรตีนที่น่าสนใจถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็นค่า DAPI
ประโยชน์ของ cistanche tubulosa-Antitumor
การวิเคราะห์ความสัมพันธ์ของ Kaplan – Meier และยีนในผู้ป่วย NB
ความสัมพันธ์ของยีน ADRB3 กับยีนจุดตรวจภูมิคุ้มกันของ CD80, CTLA4, CD276, CD226, CD40LG, 4-1BBL และความสัมพันธ์ระหว่างโดยรวม (OS) และความน่าจะเป็นของการรอดชีวิตโดยปราศจากเหตุการณ์ (EFS) ของผู้ป่วยที่มี NB และระดับ ARDB3 การแสดงออกของ mRNA ดำเนินการโดยใช้โปรไฟล์การแสดงออกของยีนของตัวอย่าง 649 NB ที่สร้างโดยใช้ไมโครอาร์เรย์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ 44 K โปรไฟล์และข้อมูลทางคลินิกถูกดึงมาจาก R2: แพลตฟอร์มการวิเคราะห์จีโนมและการแสดงภาพ (//r2.amc.nl), (Kocak, ag44kcwolf ที่กำหนดเอง, n=649 กรณี) ควอไทล์สุดท้ายของการแจกแจงถูกใช้เป็นค่าตัดการแสดงออกสำหรับการแสดงออกของยีน ADRB3 สูงและต่ำในการวิเคราะห์ Kaplan – Meier
สถิติ
การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ GraphPad Prism (GraphPad, San Diego, CA, USA) โดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวหรือสองทาง (ANOVA) ตามด้วยการทดสอบหลังเลิกงานของ Bonferroni หรือการทดสอบแบบ t-test ของนักเรียนที่ไม่มีคู่ สำหรับการทดลองในสัตว์ทดลอง ตามการศึกษาก่อนหน้านี้ในสัตว์ทดลองชนิดเดียวกัน [12] จำเป็นต้องมีหนูอย่างน้อย 6 ตัวต่อกลุ่มเพื่อรับประกันพลัง 80% ค่าจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM ความสำคัญถูกพิจารณาเมื่อ P เป็น<0.05 and described in each figure legend. Allocation concealment was performed using a randomization procedure (http:// www.randomizer.org/).
ผลลัพธ์
3-การต้าน AR ลดการแสดงออกของ PD-L1 ในเซลล์เนื้องอกของหนู A/J ที่มี NB
การศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่าการส่งสัญญาณ PD-1/PD-L1 ใน NB แสดงถึงกลไกสำคัญในการจำกัดการเฝ้าระวังภูมิคุ้มกัน และการแสดงออกของ PD-L1 มีความสัมพันธ์กับตัวบ่งชี้มะเร็งในระดับสูง [15, 16] เมื่อคำนึงถึงข้อมูลเหล่านี้และข้อมูลก่อนหน้าของเราที่แสดงให้เห็นถึงความสามารถของ 3-การปิดล้อม AR เพื่อกระตุ้น TME ที่มีภูมิคุ้มกันในหนูที่เป็นมะเร็งผิวหนัง [13] เราสงสัยว่าในเนื้องอก NB 3-AR การต่อต้านกันอาจนำไปสู่การกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันซึ่งขึ้นอยู่กับการมีส่วนร่วมในการส่งสัญญาณของ PD-L1 การบริหารให้ 3-AR แอนทาโกนิสต์ SR59230A ในแบบจำลองซินจีนิกของหนู NB ลดการเติบโตของเนื้องอกได้ในระดับที่มากกว่าการรักษาด้วย mAb ของแอนติบอดีต้าน PD-L1 (PD-L1) แต่ไม่พบผลเสริมฤทธิ์กัน เมื่อหนูได้รับการรักษาด้วยยาทั้งสองชนิด (รูปที่ 1A, B) เพื่อตรวจสอบว่าผลการต่อต้านเนื้องอกที่เกิดจากการบริหาร SR59230A นั้นอาศัยส่วนหนึ่งในการปรับการแสดงออกของ PD-L1 หรือไม่ เราได้ทำการประเมินระดับการแสดงออกของ PD-L1 ใน TME ของหนูที่มี NB สิ่งที่น่าสนใจคืออิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ (รูปที่ 1C) และการวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อต (รูปที่ 1D) บนมวลเนื้องอกของหนูทดลองแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ PD-L1 ลดลงใน TME ของหนูที่ได้รับการรักษาด้วย 3-ตัวต้าน AR เมื่อเปรียบเทียบกับสภาพของยานพาหนะ จากข้อมูลวรรณกรรมที่กว้างขวางแสดงให้เห็นว่าใน TME นอกเหนือจากเซลล์มะเร็งแล้ว เซลล์สโตรมัล เช่น เซลล์ที่สร้างแอนติเจน (APCs) MDSC, DCs และมาโครฟาจ ยังเป็นแหล่งที่มาหลักของ PD-L1 [17–20] เรายังกล่าวเพิ่มเติมอีกว่า ตรวจสอบว่าที่ใดใน TME ระดับการแสดงออก PD-L1 ได้รับผลกระทบหลังจาก 3-การปิดล้อม AR การทดสอบไซโตฟลูออโรเมตริกเปิดเผยว่า 3-การต้าน AR ลดการแสดงออกของ PD-L1 ในเซลล์เนื้องอก (รูปที่ 1E) ในขณะที่เพิ่มระดับการแสดงออกใน DC และมาโครฟาจ (รูปที่ 1F, G) ไม่มีการเปลี่ยนแปลงถูกสังเกตพบในประชากร MDSC (รูปที่ 1H) ผลลัพธ์แรกเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า 3-การปิดกั้น AR ออกฤทธิ์ต้านเนื้องอกที่มีนัยสำคัญในแบบจำลองซินจีนิกของหนูที่มี NB และการบริหารให้แอนติบอดี PDL1 ร่วมกันไม่ได้กระตุ้นให้เกิดผลเสริมฤทธิ์กันในการต้านเนื้องอก สิ่งที่น่าสนใจคือ 3-การต้านทางเภสัชวิทยาของ AR ปรับระดับการแสดงออก PDL1 ใน TME ซึ่งเสนอแนะการมีส่วนร่วมของการส่งสัญญาณ PD-L1 ในการดำเนินการต่อต้านเนื้องอกที่เกิดจาก 3-การปิดล้อม AR
รูปที่ 1 ผลของการรักษา SR59230A และ PD-L1 ต่อการเจริญเติบโตของเนื้องอกและการแสดงออกของ PD-L1 ในหนูที่มีเนื้องอก NB
3-การต่อต้าน AR และการบริหารให้ PD-L1 กระตุ้น TME ที่ไวต่อปฏิกิริยาทางภูมิคุ้มกันใน NB
เพื่อตรวจสอบว่าการแสดงออกของ PD-L1 ที่ลดลงซึ่งสังเกตได้ในเซลล์เนื้องอก NB หลังจากการต่อต้านของ 3-AR นำไปสู่การกระตุ้นภูมิคุ้มกันใน TME หรือไม่ ขั้นแรกเราได้ประเมินจำนวนของเพอร์ฟอรินด้วย PD-1+CD{ เซลล์ {4}} ในมวลเนื้องอกของหนูที่ได้รับการบำบัด SR59230A-, PD-L1- หรือ SR59203A + PD-L1- เมื่อเปรียบเทียบกับกระสายยา (รูปที่ 4A, B) นอกจากนี้ การทดสอบการย้อมสี Ki67 แสดงแนวโน้มที่บ่งชี้การแพร่กระจายที่เพิ่มขึ้นของ CD8+ ทีเซลล์ในเนื้องอก NB ของหนูที่ได้รับการรักษาด้วย 3-AR แอนทาโกนิสต์หรือ PD-L1 แอนติบอดี แม้ว่าจะล้มเหลวในการเข้าถึงที่มีนัยสำคัญ ความแตกต่าง (รูปที่ 4C) สุดท้าย การวัดไซโตไคน์แสดงให้เห็นว่าในมวลเนื้องอกของหนูที่ได้รับการบำบัดด้วย PDL1- ระดับของไซโตไคน์ที่เพิ่มขึ้นที่ทราบกันว่าออกฤทธิ์ต้านเนื้องอก เช่น TNF- , IFN- และ IL-6 และสารที่เกิดขึ้นพร้อมกัน การลดลงของ IL ของไซโตไคน์ที่กดภูมิคุ้มกัน-10 น่าแปลกที่ในหนูที่มี NB ซึ่งรับการรักษาด้วย 3- AR antagonist เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นของ TNF- และ IL -6 และการลดลงของระดับ IL -10 ตามภูมิคุ้มกัน- สถานะปฏิกิริยาที่แนะนำโดยคุณสมบัติเซลล์ T แต่ระดับ IFN- ลดลง (รูปที่ 4D) ไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในการตรวจไซโตไคน์อื่นๆ (GMCSF, IL-2, IL-1 และ IL-1 ) ข้อมูลเหล่านี้ร่วมกันแสดงให้เห็นว่า 3-การต้าน AR กระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของโฮสต์ใน TME ของหนูเมาส์ที่มี NB โดยย้อนรอยผลเดียวกันที่สังเกตพบหลังการบริหารให้แอนติบอดี PD-L1 โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การทำหน้าที่ของพิษต่อเซลล์ CD8+ ถูกทำให้แข็งแกร่งขึ้นโดยทั้ง SR59230A และ PD-L1 ไม่พบผลเสริมฤทธิ์กันเมื่อ 3- AR ตัวต้านถูกบริหารร่วมกับแอนติบอดี PD-L1 ซึ่งยืนยันว่าการกระตุ้นภูมิคุ้มกันอีกครั้งที่เกิดจาก 3- การปิดล้อม AR ขึ้นอยู่กับการส่งสัญญาณ PD-L1 อย่างน้อยในบางส่วน การมีส่วนร่วมของเส้นทาง
รูปที่ 2 SR59230A และ PD-L1 กระตุ้น TME ที่มีปฏิกิริยาทางภูมิคุ้มกันใน NB
รูปที่ 3 การแสดงออกของจุดตรวจสอบภูมิคุ้มกันบนลิมโฟไซต์ใน TME และ TDLN หลังจากการต่อต้าน 3-AR และการบริหารให้ PD-L1
รูปที่ 4 3-การปิดล้อม AR กระตุ้นการทำงานของ CD8 และควบคุมการหลั่งไซโตไคน์ของภูมิคุ้มกันใน TME
3-AR บนลิมโฟไซต์ที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอกจะปรับการหลั่ง IFN และส่งผลต่อการแสดงออกของ PD-L1 บนเซลล์เนื้องอก NB
การแสดงออกของ PD-L1 บนเซลล์เนื้องอกสามารถเกิดขึ้นได้จากหลายปัจจัย แต่เหนือสิ่งอื่นใด TNF- และ IFN- เป็นตัวแทนของไซโตไคน์หลักที่สามารถเพิ่มระดับ PD-L1 ในเนื้องอกที่แตกต่างกันได้ [23] เพื่ออธิบายเพิ่มเติมเกี่ยวกับการส่งสัญญาณที่เป็นพื้นฐานของการพูดคุยข้าม 3-AR/PD-L1 ในแบบจำลองเนื้องอกของ NB ของเรา อันดับแรกเราทำการทดสอบ ในหลอดทดลอง การแสดงออกของ PD-L1 บนเซลล์เนื้องอก N2A หลังการรักษาด้วย TNF และ IFN ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ PD-L1 ได้รับการควบคุมในเซลล์ NB ที่บำบัดเป็นเวลา 48 ชั่วโมงด้วย IFN- แต่ไม่ใช่ด้วย TNF- ยิ่งไปกว่านั้น การบำบัดล่วงหน้าของเซลล์เนื้องอก N2A ด้วย 3-AR ตัวต้าน SR59230A ไม่สามารถยกเลิกการแสดงออกของ PDL1 ที่เพิ่มขึ้นจากการบำบัดด้วย IFN (รูปที่ 5A) เมื่อพิจารณาว่าข้อมูลวรรณกรรมยอมรับว่า TIL เป็นแหล่งเซลล์หลักของ IFN- ในระหว่างการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันแบบปรับตัว [24] และผลลัพธ์ของเราเปิดเผยว่าการปรับ 3-AR บนเซลล์เนื้องอก N2A ไม่ส่งผลกระทบต่อ PD ที่ขึ้นกับ IFN- - การแสดงออกของ -L1 เราสงสัยว่าการปรับ 3- AR บน TIL มีส่วนรับผิดชอบต่อการหลั่ง IFN ที่ถูกเปลี่ยนแปลง ซึ่งจะส่งผลต่อการแสดงออกของ PD-L1 บนเซลล์เนื้องอกหรือไม่ เพื่อพิสูจน์สมมติฐานของเรา ลิมโฟไซต์ที่ได้รับจาก TDLN ของหนูที่มี NB ที่บำบัดด้วยกระสายยาหรือ SR59230A ถูกแยกและเพาะเลี้ยงร่วม ในหลอดทดลอง กับเซลล์เนื้องอก การวิเคราะห์อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์และโฟลว์ไซโตเมทรียืนยันว่าลิมโฟไซต์ที่รวบรวมจากหนูที่มี NB ที่บำบัดด้วยแอนทาโกนิสต์ 3- AR ลดความสามารถในการกระตุ้นการแสดงออกของ PD-L1 บนเซลล์ N2A เมื่อเปรียบเทียบกับลิมโฟไซต์ที่ไม่ได้รับการรักษา (รูปที่ 5B, D) นอกจากนี้ การวัดระดับ IFN ในอาหารเลี้ยงเชื้อร่วมยืนยันว่าลิมโฟไซต์ที่เก็บจากหนูที่ได้รับ SR50230A สูญเสียความสามารถในการหลั่ง IFN- บางส่วนเมื่อเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์เนื้องอก NB (รูปที่ 5C) แสดงให้เห็นแล้วว่า 3-AR อาจจับคู่กับโปรตีน Gs ในเนื้อเยื่อหลายชนิด และการกระตุ้นของมันนำไปสู่การกระตุ้นวิถีการส่งสัญญาณของ cAMP/PKA [25] ในเวลาเดียวกัน การศึกษาได้พิสูจน์บทบาทที่สำคัญของการเชื่อมโยงองค์ประกอบที่ตอบสนองต่อ AMP แบบไซคลิก (CREB) ในฐานะตัวควบคุมการถอดรหัสเชิงบวกของ IFN- ในเซลล์ T [25–27] เริ่มต้นจากการสังเกตเหล่านี้ เราประเมินว่าเส้นทางการส่งสัญญาณของค่าย/PKA/CREB เกี่ยวข้องกับการหลั่ง IFN ที่ขึ้นกับ 3- AR ใน TIL หรือไม่ ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า 3-AR antagonism ของ CD8+ TILs ลดฟอสโฟรีเลชั่นของหน่วยย่อย PKA /PKA และ CREB ซึ่งนำไปสู่การลดการแสดงออก IFN ใน CD8+ TILs (รูปที่ 1A เพิ่มเติม , บี) ผลลัพธ์เหล่านี้ยืนยันว่า 3-AR สามารถรักษาการถอดรหัส IFN ใน TIL ของ NB โดยการทริกเกอร์เส้นทางการส่งสัญญาณของ cAMP/PKA/CREB ในทางกลับกัน ไซโตไคน์ที่กดภูมิคุ้มกัน IL -10 ลดลงใน Treg ของหนูที่รักษาด้วย SR59230A เมื่อเปรียบเทียบกับยานพาหนะ (รูปที่ 1C เสริม) ยืนยันปฏิกิริยาทางภูมิคุ้มกันของ NB TME หลังจาก 3- การรักษาด้วย AR antagonist ของหนูที่มี NB เพื่อยืนยันผลการคัดเลือกของการเป็นปรปักษ์กับ SR59230A ต่อชนิดย่อย 3- AR เราได้ทำการทดสอบการเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์เม็ดเลือดขาวที่ถูกทำให้เงียบด้วย siRNA สำหรับ 1-, 2- และ 3- AR ชนิดย่อย ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าลิมโฟไซต์ปิดเสียงสำหรับ 3- AR ในกลุ่มย่อย -AR สูญเสียความสามารถในการกระตุ้นการแสดงออกของ PD-L1 บนเซลล์เนื้องอก N2A บางส่วนเมื่อเปรียบเทียบกับสภาวะการควบคุม (รูปที่ 5E และรูปที่ 1D เพิ่มเติม) ยิ่งไปกว่านั้น การแสดงออกของโปรตีนของ 3-AR บนเซลล์เม็ดเลือดขาวของ murine ของหนูที่มี NB ได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์แบบ western blot ของเซลล์เม็ดเลือดขาวที่ได้รับจาก TDLNs (รูปที่ 2A เสริม) และอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ของ CD 4+ และ CD {{ 90}} ทีเซลล์ย้อมสีสำหรับ 3- AR ในส่วนมวลเนื้องอก (รูปที่ 2B เพิ่มเติม) ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นว่าการเป็นปรปักษ์กันเฉพาะของ 3- AR บนเซลล์เนื้องอก N2A โดย SR59230A ยับยั้งการเจริญเติบโตของ NB และการลุกลามของเนื้องอก โดยการเปลี่ยนจากความสามารถในการควบคุมตัวเองไปเป็นคุณลักษณะการสร้างความแตกต่างของเซลล์เนื้องอก [12] ในที่นี้ ผลลัพธ์ของเราบอกเป็นนัยว่าผลในการต่อต้านเนื้องอกของการบริหาร 3- AR antagonist ยังอาศัยการปรับสัญญาณ AR 3- บน TIL ด้วยเช่นกัน ซึ่งนำไปสู่การฟื้นคืนการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันต่อเนื้องอก ดังนั้นเพื่อยืนยันวิทยานิพนธ์ของเรา ในวิฟ เราจึงจัดการ FTY720 เพื่อยับยั้งเซลล์ T ใน TDLN และเพื่อลดการแทรกซึมในมวลเนื้องอก FTY720 เป็นอะนาล็อกของสฟิงโกซีน 1-ฟอสเฟต (S1P) และการบริหารของสฟิงโกซีนจะกระตุ้นให้เกิดการเคลื่อนตัวภายในและการเสื่อมสภาพของตัวรับ S1P ดังนั้นจึงป้องกันไม่ให้ลิมโฟไซต์หลุดออกจากต่อมน้ำเหลือง [28] ตามที่สันนิษฐานไว้ การบำบัดล่วงหน้าด้วย FTY720 ลดฤทธิ์ต้านเนื้องอกที่เกิดจาก 3- การให้ยาต้าน AR (รูปที่ 5F–H) เพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพของ FTY720 ในการควบคุมทีเซลล์ใน TDLN เราได้วัดจำนวนทีเซลล์ใน TDLN หลังจากการรักษาแปดวัน (T8) ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าเซลล์ CD4+ และ CD8+ เพิ่มขึ้นใน TDLN ของหนูที่ได้รับการบำบัดล่วงหน้าด้วย FTY720 เมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ไม่ได้รับการรักษา (ยานพาหนะ) (รูปที่ 2C เพิ่มเติม) ตามผลลัพธ์ก่อนหน้าของเราและผลลัพธ์อื่น ๆ ที่แสดงให้เห็นว่าการส่งสัญญาณ S1P มีความสำคัญต่อการอยู่รอดของเซลล์เนื้องอก NB [12, 29] การรักษาด้วย FTY720 เพียงอย่างเดียวก็สามารถลดการเติบโตของเนื้องอกได้อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5F-H) การวิเคราะห์ลำดับ RNA บนมวลเนื้องอก NB ที่แยกได้จากยานพาหนะและหนูที่ได้รับการรักษาด้วย SR59230A ระบุยีน 5607 ยีน โดยที่ 267 ยีนมีการแสดงออกที่แตกต่างกัน (DEGs) 127 รายการได้รับการควบคุมและ 140 รายการถูกควบคุมในเนื้องอกที่ได้รับ SR59230A (รูปที่ 6A) โดยเฉพาะอย่างยิ่งยีนหลายตัวที่แสดงออกแตกต่างกันทางสถิตินั้นเป็นของวิถีทางที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันตามฐานข้อมูล GO: BP (รูปที่ 6B) ยิ่งไปกว่านั้น การลดลงของ PD-L1 mRNA (ยีน CD274) ในเนื้องอกที่ได้รับการรักษาด้วย SR59230A เมื่อเปรียบเทียบกับสภาพของยานพาหนะ และการควบคุมของยีนอื่น ๆ ที่แตกต่างกันที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการที่เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกัน (รูปที่ 6C) ยืนยันความสัมพันธ์ระหว่าง 3-AR และ จุดตรวจภูมิคุ้มกัน PD-L1 สังเกตได้ที่ระดับโปรตีน ในที่สุด การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันบนชุดข้อมูลสาธารณะ (GSE14880 จากไฟล์เก็บถาวร GEO) ซึ่งประกอบด้วยผู้ป่วย 34 รายที่ได้รับผลกระทบจาก NB ยืนยันว่ามวลเนื้องอก NB ที่มี ADRB3 การแสดงออกต่ำแสดงการควบคุมเชิงบวกของการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน การกระตุ้นเซลล์ T และเอฟเฟกต์ภูมิคุ้มกัน วิถีทางเมื่อเปรียบเทียบกับมวลเนื้องอกที่มีระดับ ADRB3 สูง (รูปที่ 6D) โปรดทราบว่าในขณะที่อยู่ในมะเร็งชนิดต่างๆ catecholamines จะถูกปล่อยออกมาผ่านเซลล์ประสาทที่เกี่ยวข้องกับมะเร็งหรือเพียงเข้าถึงเนื้องอกผ่านการไหลเวียนโลหิต ใน NB ระดับที่มากเกินไปของ catecholamines และสารเมตาโบไลต์ของพวกมัน (HVA, VMA, โดปามีน) ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของมะเร็งนี้มีต้นกำเนิดมาจาก จากแหล่งอื่น อันที่จริง เนื่องจากต้นกำเนิดที่แปลกประหลาดของเซลล์ NB (จากเซลล์สร้างความแตกต่างของเซลล์ประสาทที่เห็นอกเห็นใจที่มีข้อบกพร่องของยอดเซลล์ประสาท) เนื้องอกเหล่านี้มักจะสามารถหลั่ง catecholamines ได้ด้วยตัวเอง อันที่จริง ในแบบจำลอง NB ของหนู อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์บนมวลเนื้องอกแสดงให้เห็นว่าเซลล์เนื้องอก NB เป็นผลบวกต่อโดปามีน - ไฮดรอกซีเลส (DBH) (รูปที่ 3A เสริม) ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่รับผิดชอบในการสังเคราะห์นอร์เอพิเนฟริน โดยไม่คำนึงถึง 3- การแสดงออกของ AR บนเนื้องอกหรือการเป็นปรปักษ์กัน เมื่อนำมารวมกัน ข้อมูลเหล่านี้เน้นย้ำถึงบทบาทที่สำคัญของการส่งสัญญาณ -อะดรีเนอร์จิกในการควบคุมกระบวนการทางชีวภาพต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์ระหว่างระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์และสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกในเนื้องอก NB ผลของการต่อต้านเนื้องอกที่สังเกตได้หลังการบริหาร 3- AR antagonist ในแบบจำลองซินจีนิกของหนูของเรา อย่างน้อยในบางส่วนต้องอาศัยการปรับ 3- AR ที่แสดงออกบนลิมโฟไซต์ที่แทรกซึมเข้าไปในมวลเนื้องอก โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราได้แสดงให้เห็นว่าการปิดล้อมแบบเลือกสรรของ 3-AR บน TIL ลดการหลั่ง IFN ซึ่งในทางกลับกันจะลดการแสดงออกของ PD-L1 บนเซลล์เนื้องอก NB ซึ่งส่งเสริม TME ที่ไวต่อปฏิกิริยาของระบบภูมิคุ้มกัน
รูปที่ 5 3-AR บน TIL คงไว้ซึ่งการแสดงออกของ PD-L1 ที่ขึ้นกับ IFN- - ในเซลล์เนื้องอก NB ก
การแสดงออกของยีน ADRB3 มีความสัมพันธ์กับการพยากรณ์โรคที่ไม่ดีในผู้ป่วย NB
การศึกษาบางชิ้นชี้ให้เห็นว่า {{0}}AR mRNA และ/หรือโปรตีนมีการแสดงออกมากเกินไป และในบางกรณีมีความสัมพันธ์กับการแพร่กระจายและการเปลี่ยนแปลงของเนื้องอกในมะเร็งของมนุษย์ที่แตกต่างกัน [10, 30–32] ดังนั้น ผลลัพธ์พรีคลินิกของเราที่ได้รับในแบบจำลองหนูสังเคราะห์ของ NB แสดงให้เห็นว่า 3-การส่งสัญญาณ AR สามารถรักษากระบวนการก่อเนื้องอกที่แตกต่างกันซึ่งสนับสนุนการเติบโตของเนื้องอกได้ ดังนั้นเพื่อทดสอบว่าการแสดงออกของยีน ADRB3 มีความสัมพันธ์กับความอยู่รอดของผู้ป่วย NB หรือไม่ เราทำการวิเคราะห์ Kaplan – Meier ผ่าน R2: แพลตฟอร์มการวิเคราะห์และการสร้างภาพจีโนมิกส์ (//r2.amc.nl) โดยใช้ฐานข้อมูล Kocak ซึ่งรวมถึง ข้อมูลที่สมบูรณ์เกี่ยวกับข้อมูลทางคลินิกของผู้ป่วย 649 NB ผลการศึกษาพบว่าการแสดงออกของยีน ADRB3 มีความสัมพันธ์กับผลลัพธ์ที่ไม่ดีในผู้ป่วย NB การแสดงออกในระดับสูงของยีน ADRB3 นั้นมีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับการไม่มีเหตุการณ์ที่ลดลง (p=3.2e−05) (รูปที่ 7A) และความอยู่รอดโดยรวม (p=8.4e−0.5) ( รูปที่ 7B) ของผู้ป่วย NB นอกจากนี้ การวิเคราะห์ความสัมพันธ์ของยีนในบางกลุ่มแสดงความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่าง ADRB3 และยีนสำหรับจุดตรวจสอบภูมิคุ้มกันแบบยับยั้ง เช่น CD80, CTLA4 และ CD276 และความสัมพันธ์เชิงลบกับยีนสำหรับจุดตรวจสอบภูมิคุ้มกันที่กระตุ้นระบบภูมิคุ้มกัน เช่น CD266 CD40 ลิแกนด์ (CD40LG) และ 4-1BB ลิแกนด์ (4-1BBL) (รูปที่ 7C) โดยรวมแล้ว ข้อมูลที่ได้รับเน้นถึงความสัมพันธ์เชิงลบของการแสดงออกของยีน ADRB3 กับผลลัพธ์ของผู้ป่วย NB และยืนยันและเสริมสร้างบทบาทของ 3-AR ในฐานะผู้เล่นระดับโมเลกุลที่สามารถรองรับการตอบสนองของภูมิคุ้มกันต่อต้านเนื้องอกโดยส่งผลกระทบต่อจุดตรวจภูมิคุ้มกันหลายจุด เส้นทางการส่งสัญญาณ
การอภิปราย
เนื่องจากมีต้นกำเนิดจากระบบประสาทที่แปลกประหลาด สาร catecholamine ในระดับสูงจึงเป็นตัวกำหนดลักษณะของเนื้องอก NB [7, 33] ในงานก่อนหน้านี้ เราคาดการณ์ว่าการปล่อย catecholamine ใน TME อาจกำหนดเป้าหมายเซลล์มะเร็งผ่านการกระตุ้น -ARs ซึ่งกระตุ้นให้เกิดการเติบโตและความร้ายกาจในมะเร็ง NB แท้จริงแล้ว ข้อมูลการทดลองแสดงให้เห็นว่า 3-AR ถูกแสดงออกบนบรรทัดเซลล์เนื้องอก NB และการตัดชิ้นเนื้อจากผู้ป่วยที่แตกต่างกัน และการปรับค่าของมันส่งผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อการเจริญเติบโตของเนื้องอกในแบบจำลองหนูสังเคราะห์ของ NB [12] นอกจากการแสดงออกของ -ARs บนเซลล์เนื้องอกแล้ว เป็นที่ทราบกันดีว่า -ARs ตั้งอยู่บนพื้นผิวของเซลล์ส่วนใหญ่ใน TME รวมถึงเซลล์ภูมิคุ้มกันด้วย และนั่นก็คือ การผูกมัดของ catecholamines กับ -ARs ในเซลล์ภูมิคุ้มกันจะควบคุมทั้งภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดและภูมิคุ้มกันแบบปรับตัว [34]. โปรดทราบว่าในขณะที่อยู่ภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา การปรับระบบภูมิคุ้มกันโดยการส่งสัญญาณ -adrenergic ส่งเสริมการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันตามปกติ ในกระบวนการที่เปลี่ยนแปลง SNS/catecholamines/ - การกระตุ้นที่ยืดเยื้อของ ARs อาจส่งผลเสียต่อเซลล์ภูมิคุ้มกันต่างๆ รวมถึงเซลล์เม็ดเลือดขาว [35, 36 ] ในสภาวะที่เปลี่ยนแปลงเหล่านี้ การกระตุ้นการส่งสัญญาณอะดรีเนอร์จิกอย่างต่อเนื่องจะส่งเสริมกระบวนการทางพยาธิวิทยา และเหนือสิ่งอื่นใด การลุกลามของมะเร็ง [37] เริ่มต้นจากการสังเกตข้างต้น การศึกษาของเรามีจุดมุ่งหมายที่จะตรวจสอบว่าผลในการต่อต้านเนื้องอกที่เกิดจาก 3-การต่อต้าน AR ในเนื้องอก NB ส่วนหนึ่งอาจขึ้นอยู่กับการฟื้นคืนภูมิคุ้มกันของภูมิคุ้มกันต่อต้านเนื้องอกหรือไม่ และสิ่งนี้อาจเกี่ยวข้องกับหรือไม่ การปรับจุดตรวจภูมิคุ้มกันเพื่อส่งสัญญาณเส้นทาง การศึกษาพรีคลินิกแนะนำว่าการแสดงออกของ PD-L1 ใน NB ในระยะแพร่กระจายแสดงถึงกลไกสำคัญในการจำกัดการเฝ้าระวังภูมิคุ้มกัน [15] และการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันร่วมกับ anti-PD-L1/ PD{-1 และแอนติบอดีต่อต้าน CD4 จะรักษา NB ที่แพร่กระจายแบบซินจีนิก [ 38]. เมื่อเร็ว ๆ นี้ มีการประเมินการแสดงออกของ PD-L1 ในเนื้องอกในเด็กหลายชนิด และเหนือสิ่งอื่นใด การย้อมสี PD-L1 มีความสัมพันธ์กับอัตราการรอดชีวิตที่ด้อยกว่าในผู้ป่วย NB [16, 39] ยิ่งไปกว่านั้น แสดงให้เห็นว่าเนื้องอกเชิงบวกของ PD-L1-อยู่ในต่อมหมวกไตบ่อยกว่าเนื้องอกเชิงลบของ PD-L1- และเมตาบอไลต์ของคาเทโคลามีน (NSE, VMA และ HVA) มีแนวโน้มที่จะเป็น สูงกว่าในกลุ่ม PD-L1-ที่เป็นบวก มากกว่าในกลุ่ม PD-L1-ที่เป็นลบ [16]
cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน
หลักฐานนี้ชี้ให้เห็นถึงความสามารถของแกนส่งสัญญาณ PD-1/PD-L1 ในการควบคุมการหลบหนีของภูมิคุ้มกันของเนื้องอกใน NB หลักและระยะแพร่กระจาย อย่างไรก็ตาม พวกเขาไม่ได้ตรวจสอบกลไกที่แม่นยำที่เป็นรากฐานของ PD-1/PD- ระเบียบการส่งสัญญาณ L1 เพื่อตรวจสอบว่า 3-การปรับ AR อาจส่งผลต่อการแสดงออกของ PD-L1 ใน NB และผลที่ตามมาของปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันใน TME หรือไม่ เราได้ทำการรักษาหนู A/J ที่ได้รับการฉีดวัคซีนด้วยเซลล์ N2A NB ที่สังเคราะห์ขึ้น โดยมี 3- สารต้าน AR SR59230A, โมโนโคลนอลแอนติบอดี PD-L1 (PD-L1) หรือการรวมกันของพวกมัน อันดับแรก เราสังเกตว่า 3-การต้าน AR สามารถลดการเติบโตของเนื้องอก NB และลดการแสดงออกของ PD-L1 พร้อมกันใน TME ของหนูที่มี NB Flow cytometry เปิดเผยว่าปริมาณ PD-L1 ที่ลดลงที่พบในมวลเนื้องอกของหนูที่ได้รับ SR59230A ส่วนใหญ่สะท้อนถึงการแสดงออกที่ลดลงของเซลล์เนื้องอก ในทางตรงกันข้าม การแสดงออกของ PD-L1 บน DC และมาโครฟาจได้รับการควบคุม หลักฐานทางวิทยาศาสตร์หลายประการที่กำหนดให้กับ PD-L1 ที่อยู่ในทั้งเซลล์เนื้องอกและ APCs มีความสามารถในการรองรับการกระตุ้นการทำงานของทีเซลล์ ซึ่งบางส่วนขัดขวางปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันที่มีประสิทธิผลต่อเนื้องอก [40] อย่างไรก็ตาม การศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่าในระหว่างการดูดซึมแอนติเจนและการนำเสนอข้ามแอนติเจนของเนื้องอกไปยังทีเซลล์ ขั้นตอนสำคัญในภูมิคุ้มกันแบบปรับตัว DC และมาโครฟาจจะควบคุม PD-L1 ซึ่งจำกัดการกระตุ้นการทำงานของทีเซลล์มากเกินไป และปกป้องพวกมันจากกิจกรรมที่เป็นพิษต่อเซลล์ของ ทีเซลล์ [41, 42] ดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐานว่าการแสดงออกที่ลดลงของ PD-L1 ในเซลล์เนื้องอกและการเพิ่มขึ้นพร้อมกันใน APCs ในมวลเนื้องอกที่ได้รับการรักษาด้วย SR59230A น่าจะสะท้อนถึงการฟื้นฟูระบบภูมิคุ้มกันใน TME ผลลัพธ์ยืนยันจำนวนที่เพิ่มขึ้นของเซลล์ที่ไวต่อปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอก (NK, DCs และ CD8+) และการลดลงของเซลล์กดภูมิคุ้มกันที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอก (Treg และ MDSC) การวิเคราะห์การแสดงออกของจุดตรวจภูมิคุ้มกัน PD-1 บน TIL แสดงจำนวนทีเซลล์ PD-1+CD4+ และ PD- 1+CD8+ เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน TDLN ที่ ระยะแรกของการพัฒนาของเนื้องอก (T2) และของ PD-1+CD8+ ในเนื้องอกหลังจาก 8 วัน (T8) ของ SR59230A, PD-L1 หรือการบำบัดแบบผสมผสานของพวกมันเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม แนวโน้มที่เพิ่มขึ้นยังถูกบันทึกไว้ในจำนวน CD4+ ทีเซลล์ที่ย้อมสำหรับ TIM3 หรือ LAG3 ในเนื้องอกของการบำบัดด้วย SR59230A, PD-L1 และการรวมกันของพวกมัน แต่พวกมันล้มเหลวในการบรรลุนัยสำคัญทางสถิติ สำหรับทีเซลล์ CD8+ ที่ย้อมสำหรับ TIM3 หรือ LAG3 เราสังเกตเห็นความแปรปรวนใหญ่แทน แม้ว่าข้อมูลวรรณกรรมบางส่วนชี้ให้เห็นว่า PD-1, LAG-3 และ TIM-3 ที่แสดงทีเซลล์หมดแรงและทำงานผิดปกติ [43–45] แต่ข้อมูลอื่นๆ แสดงให้เห็นว่าจุดตรวจภูมิคุ้มกันเหล่านี้ โดยเฉพาะ PD -1 ยังได้รับการควบคุมหลังจากการเปิดใช้งานและการสร้างความแตกต่างของเอฟเฟกต์ทีเซลล์ [46–48] ดังนั้นการแสดงออกต่อ se จึงไม่สะท้อนถึงสถานะที่หมดแรง แต่เครื่องหมายเหล่านี้จะระบุรายการที่แสดงปฏิกิริยาต่อเนื้องอกแบบ autologous ที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอกที่แตกต่างกัน [46– 49]. ตามข้อตกลง การตรวจสอบเชิงลึกในแบบจำลองเนื้องอกของเรายืนยันว่า 3-การต่อต้าน AR ขณะรักษาด้วย anti-PD-L1 mAb ได้กระตุ้นการทำงานของพิษต่อเซลล์ของ CD8+ ดังที่แสดงโดยจำนวน PD ที่เพิ่มขึ้น เซลล์ 1+CD8+ ที่ถูกย้อมด้วยเพอร์ฟอรินหรือแกรนไซม์ B ซึ่งยืนยันว่า PD1+ TIL ที่พบในมวลเนื้องอกมีฤทธิ์เชิงหน้าที่ได้ การแทรกซึมของ CD8+ cytotoxic T cells ในเนื้องอกในระดับสูงแสดงให้เห็นว่าสัมพันธ์กับการพยากรณ์โรคเชิงบวกในผู้ป่วยมะเร็งหลายชนิด รวมถึงมะเร็งผิวหนัง ศีรษะและคอ เต้านม ลำไส้ใหญ่ รังไข่ ต่อมลูกหมาก และมะเร็งอื่นๆ [50] ใน NB การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้แสดงให้เห็นว่าเนื้องอกที่เสริมด้วย T เซลล์ที่แทรกซึมของเนื้องอกนั้นมีผลทางคลินิกที่ดีกว่า โดยไม่ขึ้นอยู่กับตัวชี้วัดอื่น ๆ ในปัจจุบันที่นำมาใช้สำหรับการแบ่งระยะของเนื้องอก [51] นอกจากนี้ การค้นพบล่าสุดแสดงให้เห็นว่าการมีอยู่ของเซลล์ DC และ NK ในมวลเนื้องอกมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับการแทรกซึมของทีเซลล์และผลลัพธ์ทางคลินิกเชิงบวกของผู้ป่วย NB [52] หลักฐานทางคลินิกทั้งหมดนี้เห็นด้วยกับผลลัพธ์พรีคลินิกของเรา ซึ่ง TME ที่เสริมด้วย NK, DC และ CD8+ ทีเซลล์ ซึ่งสังเกตได้หลังจากการต่อต้าน AR 3- หรือการบริหาร PD-L1 นั้นสามารถทำงานได้ตามหน้าที่ ควบคุมการเจริญเติบโตของเนื้องอก NB ลักษณะพื้นฐานของความท้าทายของระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์ต่อเนื้องอกคือการปล่อยไซโตไคน์ต่างๆ ใน TME ซึ่งสามารถรักษาหรือทำให้กิจกรรมต่อต้านเนื้องอกหายไปได้ การตรวจวัดไซโตไคน์ในเนื้องอกที่ได้รับการยืนยันในหนูที่ได้รับการรักษาด้วย SR59230A- และ PD-L{1- สภาวะได้เปลี่ยนไปสู่ TME ที่มีปฏิกิริยาทางภูมิคุ้มกัน อย่างไรก็ตาม แม้ว่าระดับไซโตไคน์ต้านเนื้องอก ระดับ TNF- และ IL{101}} จะเพิ่มขึ้น แต่ระดับ IFN ก็ลดลงในมวลเนื้องอกของหนูที่ได้รับการรักษาด้วย AR antagonist 3- จากการสังเกตนี้ เราตั้งสมมติฐานว่าการปรับ 3-การส่งสัญญาณ AR บนทีเซลล์ที่แทรกซึมของเนื้องอก โดยเฉพาะบน CD4+ และ CD8+ อาจรับผิดชอบต่อการเปลี่ยนแปลง IFN- การหลั่งซึ่งจะส่งผลต่อการแสดงออกของ PD-L1 บนเซลล์เนื้องอก ผลลัพธ์ยืนยันสมมติฐานของเรา การต่อต้านแบบเลือก 3-AR บน TIL ทำให้เซลล์เหล่านี้ไม่มีประสิทธิภาพในการกระตุ้นการแสดงออกของ PD-L1 บนเซลล์เนื้องอก NB เนื่องจากการหลั่ง IFN- ที่ถูกเปลี่ยนแปลง และขัดขวางโดยพฤตินัยในการสร้างความต้านทานต่อภูมิคุ้มกันแบบปรับตัว ใน TME IFN- ควบคุมทั้งการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ก่อให้เกิดเนื้องอกและต่อต้านเนื้องอก โดยทำหน้าที่เป็นไซโตไคน์ที่เป็นพิษต่อเซลล์ร่วมกับแกรนไซม์ บี และเพอร์ฟอริน เพื่อโจมตีเซลล์เนื้องอก แต่ยังกระตุ้นการสังเคราะห์จุดตรวจภูมิคุ้มกันที่ยับยั้ง ซึ่งจะช่วยกระตุ้นกลไกปราบปรามภูมิคุ้มกัน [53] บทบาทแบบไบโมดัลของ IFN- ในการก่อให้เกิดผลตรงกันข้ามนั้นขึ้นอยู่กับกลไกที่ซับซ้อนซึ่งยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ อย่างไรก็ตาม ปริมาณของ IFN ที่หลั่งออกมาดูเหมือนจะมีความสำคัญในการกำหนดการกระทำที่เกิดจากไซโตไคน์นี้ [54] ดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐานว่าในแบบจำลองของเรา จำนวน IFN- ที่ลดลงซึ่งเกิดจากการต่อต้านของ AR 3- บน TIL นั้นสนับสนุนการตอบสนองของภูมิคุ้มกันเมื่อเปรียบเทียบกับเงื่อนไขการควบคุม ซึ่งการได้รับ IFN เรื้อรังจะบังคับให้กลไกภูมิคุ้มกันมีมากขึ้น ในบรรดาประเภทย่อย -AR นั้น 2-AR ดูเหมือนจะแสดงออกมากที่สุดบนพื้นผิวของเซลล์ภูมิคุ้มกันหลากหลายชนิด อย่างไรก็ตาม ควรสังเกตว่า 3-AR ซึ่งเป็นสมาชิกที่ระบุล่าสุดของ -ARs ได้รับการศึกษาล่าสุดน้อยที่สุด ดังนั้น เพื่อยืนยันว่าการบริหาร SR59230A ให้ผลในการบล็อกประเภทย่อย 3-AR เป็นหลัก เราจึงตรวจสอบและยืนยันการแสดงออกของโปรตีน 3- AR บนลิมโฟไซต์ของ TDLN และใน T เซลล์ที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอก เราสาธิตการแสดงออกของ 3-โปรตีน AR ใน CD ที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอก4+ และ CD8+ จากนั้นจึงแสดงผ่านการคัดเลือก 1-, 2- และ {{ 140}}การปิดเสียง ARs เราได้ยืนยันบทบาทที่โดดเด่นของชนิดย่อย 3-AR ซึ่งอยู่บนลิมโฟไซต์ ในการควบคุมการแสดงออกของ PD-L1 ที่ขึ้นกับ IFN- - บนเซลล์เนื้องอก NB โปรดทราบว่า ข้อมูลที่ครอบคลุมเกี่ยวกับเนื้อเยื่อและแบบจำลองเซลล์ต่างๆ ได้แสดงให้เห็นว่าในขณะที่ 1-} และ 2- AR มีแนวโน้มที่จะเกิดปรากฏการณ์ของการลดความไวที่คล้ายคลึงกันมากกว่า หลังจากได้รับสาร catecholamines จากภายนอกเป็นเวลานาน {{147} }ประเภทย่อย AR แสดงให้เห็นว่าไม่เป็น และเมื่อในบางเซลล์ 3-การลดความไวของ ARs เกิดขึ้น จะเด่นชัดน้อยกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับประเภทย่อยของ 1- และ 2-ARs [ 55]. จากนั้น เราคาดการณ์ว่าในเนื้องอก NB ซึ่งเป็นภาวะที่มีลักษณะเฉพาะจากการสัมผัสกับคาเทโคลามีนเรื้อรัง 2-ชนิดย่อย AR บน TILs ซึ่งแสดงออกทางสรีรวิทยามากที่สุด อาจได้รับการควบคุมลดลงหลังการลดความไว และในทางกลับกัน 3-AR ได้รับ บทบาทสำคัญในการไกล่เกลี่ยผลกระทบต่อเนื้องอกที่เกิดจาก catecholamine ในการตรวจสอบในมนุษย์ถึงความโน้มเอียงของการแสดงออกของ 3- AR ในมนุษย์ ในที่สุดเราก็ได้ทำการวิเคราะห์ทางพันธุกรรมกับผู้ป่วย 649 NB โดยใช้การเข้าถึงแบบเปิด R2: แพลตฟอร์มการวิเคราะห์จีโนมิกส์และการแสดงภาพ การแสดงออกของยีน ADRB3 สูงมีความสัมพันธ์กับผลลัพธ์ทางคลินิกที่เลวร้ายที่สุด (การอยู่รอดโดยรวมและปราศจากเหตุการณ์) ของผู้ป่วย NB เมื่อเปรียบเทียบกับการแสดงออกที่ต่ำกว่า นอกจากนี้ ความสัมพันธ์เชิงบวกของยีน ADRB3 กับจุดตรวจสอบการกดภูมิคุ้มกันที่แตกต่างกัน เช่น CD80, CTLA4 และ B7-H3 (CD276) และความสัมพันธ์เชิงลบกับจุดตรวจสอบการกระตุ้นภูมิคุ้มกัน เช่น CD266, CD40LG และ 4-1 BBL ยืนยันบทบาทเชิงลบของ 3-AR ในการควบคุมที่ซับซ้อนของปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันใน NB โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ความสัมพันธ์เชิงบวกของการแสดงออกของยีน ADRB3 กับจุดตรวจกดภูมิคุ้มกัน เช่น CD276 ซึ่งเป็นโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับ NB ที่พบในตัวแปร NB ที่ไม่ตอบสนอง ซึ่งมีบทบาทในการป้องกันจากการสลายที่ใช้เซลล์ NK [56, 57] หรือด้วย CTLA4 ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการยับยั้งไม่ซ้ำซ้อนในการเพิ่มการฆ่าเซลล์ต้านมะเร็งใน NB [58] ได้เน้นย้ำถึงความสามารถของ 3-การส่งสัญญาณ AR เพื่อรักษากลไกต่างๆ ที่ชื่นชอบการหลบหนีของภูมิคุ้มกันของเนื้องอก เราสามารถคาดเดาได้ว่าความสัมพันธ์ระหว่างการแสดงออกของยีน ADRB3 ที่สูงกับการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของจุดตรวจภูมิคุ้มกันต่างๆ อาจขึ้นอยู่กับความสามารถ 3- AR ในการรักษากลไกเหล่านั้นซึ่งการทำงานมากเกินไปจะส่งเสริมการโจมตีของความต้านทานต่อเนื้องอก เช่น การสัมผัสกับผู้เชี่ยวชาญบางคนอย่างเรื้อรัง -ไซโตไคน์อักเสบ การศึกษาการยับยั้งจุดตรวจในระยะเริ่มแรกใน NB ยังไม่ประสบความสำเร็จเสมอไป โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ทั้งในแบบจำลองการศึกษาพรีคลินิกและในมนุษย์ การตอบสนองที่ดีขึ้นที่ได้รับในกลยุทธ์การรักษาที่ใช้ ICI หลายรายการ ชี้ให้เห็นว่าการกำหนดเป้าหมายจุดตรวจภูมิคุ้มกันที่แตกต่างกันแสดงถึงวิธีการต่อต้านเนื้องอกที่มีประสิทธิผลที่ไม่ซ้ำซ้อนใน NB [58, 59] จากนั้น การกำหนดเป้าหมายวิถีทางภูมิคุ้มกันที่แตกต่างกันอาจเป็นทางเลือกในการรักษาที่ดีที่สุดเพื่อหลีกเลี่ยงการดื้อต่อเนื้องอกของการรักษาแบบกำหนดเป้าหมายเดียว อย่างไรก็ตาม การใช้ยาหลายชนิดมักเป็นปัญหาเสมอไป เนื่องจากมีผลข้างเคียงและความเป็นพิษสูง และไม่ได้นำไปสู่ผลลัพธ์ที่ต้องการเสมอไป ดังนั้น ความรู้เชิงลึกเกี่ยวกับกลไกระดับโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมเครือข่ายที่ซับซ้อนของระบบภูมิคุ้มกันของ TME จึงเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการพัฒนาแนวทางภูมิคุ้มกันและมะเร็งวิทยาแบบใหม่ ในบริบทนี้ ผลลัพธ์ที่นำเสนอแนะนำว่าการกำหนดเป้าหมาย 3-AR ใน NB TME อาจเป็นตัวแทนแนวทางที่เป็นไปได้ในการเข้าสู่เส้นทางการส่งสัญญาณโปรเนื้องอกที่ไม่ซ้ำซ้อนหลายเส้นทาง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง โดยส่งผลกระทบต่อทั้งระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์ โดยการกำจัดสิ่งกีดขวางที่เกิดจากความร่วมมือของจุดตรวจภูมิคุ้มกัน และเส้นทางการอยู่รอดของเซลล์เนื้องอก 3-การต่อต้าน AR อาจเป็นตัวแทนของกลยุทธ์ที่น่าหวังด้วยความหวังในการรักษา ศักยภาพของผู้ป่วยที่ได้รับผลกระทบจากมะเร็ง NB ยังจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อเจาะลึกกลไกเพิ่มเติมที่เป็นพื้นฐานของปฏิสัมพันธ์ที่ซับซ้อนระหว่างระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์และคู่ของเนื้องอกใน NB อย่างไรก็ตาม จากสิ่งที่เราสังเกตเห็น การศึกษาการส่งสัญญาณ -adrenergic ใน TME ของเนื้องอก NB สมควรที่จะนำมาพิจารณาด้วย
รูปที่ 6 การวิเคราะห์ถอดเสียงของมวลเนื้องอก NB ยืนยันบทบาทที่โดดเด่นของ 3-AR ในการส่งผลต่อกระบวนการที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกัน
รูปที่ 7 การวิเคราะห์การอยู่รอดของ Kaplan – Meier และจุดตรวจภูมิคุ้มกันสัมพันธ์กับการแสดงออกของยีน ADRB3 ในผู้ป่วย NB
ข้อมูลอ้างอิง
1. เฉิง NK, ไดเออร์ MA. Neuroblastoma: ชีววิทยาพัฒนาการ จีโนมมะเร็ง และการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกัน แนท เรฟ มะเร็ง. 2013;13:397–411.
2. Matthay KK, Maris JM, Gudrun S, Nakagawara A, Mackal CL, Diller L, และคณะ นิวโรบลาสโตมา แนท เรอดิส พริม. 2016;2:16078.
3. Darvin P, Toor SM, Nair SN, Elkord E. สารยับยั้งจุดตรวจภูมิคุ้มกัน: ความคืบหน้าล่าสุดและตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่อาจเกิดขึ้น ประสบการณ์ Mol Med 2018;50:1–11.
4. แพดอล DM. การปิดกั้นจุดตรวจภูมิคุ้มกันในการรักษาโรคมะเร็ง แนท เรฟ มะเร็ง. 2012;12:252–64.
5. Zou W, Wolchok JD, Chen L. PD-L1 (B7-H1) และ PD-1 การปิดล้อมวิถีทางสำหรับการรักษาโรคมะเร็ง: กลไก ตัวบ่งชี้ทางชีวภาพในการตอบสนอง และการรวมกัน วิทย์แปลเมด 2016;8:328rv4.
6. โคล เอสดับบลิว, สุด เอเค วิถีโมเลกุล: การส่งสัญญาณเบต้า - อะดรีเนอร์จิกในมะเร็ง คลินิกมะเร็ง Res. 2012;18:1201–6.
7. Strenger V, Kerlb R, Dornbusch HJ, Ladenstein R, Ambros PF, Ambros IM และคณะ ผลกระทบจากการวินิจฉัยและการพยากรณ์โรคของ catecholamines ในปัสสาวะในผู้ป่วย neuroblastoma มะเร็งเลือดในเด็ก 2007;48:504–9.
8. Huang XE, Hamajima N, Saito T, Matsuo K, Mizutani M, Iwata H และอื่นๆ ความสัมพันธ์ที่เป็นไปได้ของยีนเบตา2- และเบต้า3-ความหลากหลายของยีนตัวรับอะดรีเนอร์จิกกับความไวต่อมะเร็งเต้านม มะเร็งเต้านม Res. 2001;3:264–9.
9. Babol K, Przybylowska K, Lukaszek M, Pertynski T, Blasiak J. ความสัมพันธ์ระหว่าง Trp64Arg polymorphism ในยีน beta3-adrenergic receptor กับมะเร็งเยื่อบุโพรงมดลูกและโรคอ้วน J Exp Clin มะเร็ง Res. 2004;23:669–74.
10. Perrone MG, Notarnicola M, Caruso MG, Tutino V, Scilimati A. การควบคุม mRNA ของ beta3-adrenergic receptor ในมะเร็งลำไส้ใหญ่ของมนุษย์: การศึกษาเบื้องต้น เนื้องอกวิทยา 2008;75:224–9.
11. Magnon C, Hall SJ, Lin J, Xue X, Gerber L, Freedland SJ และอื่นๆ การพัฒนาเส้นประสาทอัตโนมัติมีส่วนช่วยในการลุกลามของมะเร็งต่อมลูกหมาก ศาสตร์. 2013;341:1236361.
12. บรูโน จี, เชนเซ็ตติ เอฟ, พินี เอ, ทอนโด เอ, กุซซับโบ ดี, ฟอนทานา เอฟ และอื่นๆ การปิดล้อมตัวรับอะดรีโนรีเซพเตอร์แบบเบต้า3- ช่วยลดการเติบโตของเนื้องอกและเพิ่มความแตกต่างของเส้นประสาทในนิวโรบลาสโตมาผ่านการปรับ SK2/S1P2 อองโคยีน 2020;39:368–84.
13. คัลวานี เอ็ม, บรูโน จี, ดาล มอนเต เอ็ม, นาสซินี อาร์, ฟอนทานา เอฟ, คาซินี เอ และคณะ เบต้า3 -อะดรีโนเซปเตอร์เป็นสารที่มีศักยภาพในการกดภูมิคุ้มกันในมะเร็งผิวหนัง พี่เจ ฟาร์มา. 2019;176:2509–24.
14. Dal Monte M, Casini G, Filippi L, Nicchia MG, Svelto M, Bagnoli P. การมีส่วนร่วมทางหน้าที่ของ beta3-adrenergic receptors ในการเจริญเติบโตของมะเร็งผิวหนังและการสร้างหลอดเลือด เจ โมล เมด. 2013;91:1407–19.
15. ดอนเดโร เอ, ปาสโตริโน เอฟ, เดลลา คิเอซา เอ็ม, คอร์เรียส เอ็มวี, โมรันดี เอฟ, พิสโตเอีย วี และคณะ การแสดงออกของ PDL1 ใน neuroblastoma ระยะลุกลามเป็นกลไกเพิ่มเติมในการจำกัดการเฝ้าระวังภูมิคุ้มกัน มะเร็งวิทยา. 2016;5:e1064578.
16. Zuo S, Sho M, Sawai T, Kanehiro H, Maeda K, Yoshida M, และคณะ บทบาทที่เป็นไปได้ของการแสดงออกของ PD-L1 และเซลล์เม็ดเลือดขาวที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอกในนิวโรบลาสโตมา กุมารศัลยกรรมนานาชาติ 2020;36:137–43.
17. เคียร์ เอ็มอี, บัตต์ เอ็มเจ, ฟีแมน จีเจ, ชาร์ป เอเอช PD-1 และลิแกนด์ของมันในด้านความทนทานและภูมิคุ้มกัน อนุ เรฟ อิมมูนอล. 2008;26:677–704.
18. Curiel TJ, Wei S, Dong H, Alvarez X, Cheng P, Mottram P, และคณะ การปิดกั้น B7-H1 ปรับปรุงภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอกที่มีเซลล์เป็นสื่อกลางแบบมัยอีลอยด์ แนท เมด. 2003;9:562–7.
19. Wu K, Kryczek I, Cheng L, Zou W, Welling TH. การปราบปรามเซลล์ Kupffer ของ CD8+ ทีเซลล์ในมะเร็งเซลล์ตับของมนุษย์เป็นสื่อกลางโดยอันตรกิริยาของ B7-H1/การเสียชีวิตแบบโปรแกรม-1 มะเร็ง Res 2009;69:8067–75.
20. Kuang DM, Zhao Q, Peng C, Xu J, Zhang JP, Wu C และอื่นๆ โมโนไซต์ที่ถูกกระตุ้นในสโตรมาทางช่องท้องของมะเร็งเซลล์ตับส่งเสริมสิทธิพิเศษทางภูมิคุ้มกันและการลุกลามของโรคผ่าน PD-L1 เจเอ็กซ์พีเมด 2009;206:1327–37.
21 Rotte A, Jin JY, Lemaire V. ภาพรวมเชิงกลไกของจุดตรวจภูมิคุ้มกันเพื่อสนับสนุนการออกแบบที่มีเหตุผลของการผสมผสานในการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันบำบัดมะเร็ง แอน ออนคอล. 2018;29:71–83.
22. ดัมเมย์เยอร์ เอฟ, ฟาน กูลิจ์ค เอ็ม, มัลเดอร์ EE, ลุคเคส เอ็ม, คลาส แอล, ฟาน เดน บอช ที, และคณะ จุดตรวจสอบ PD-1/PD-L1 ยับยั้งภูมิคุ้มกันของทีเซลล์ในต่อมน้ำเหลืองที่ระบายเนื้องอก เซลล์มะเร็ง. 2020;38:685–700. e8.
23. ชา JH, ชาน LC, Li CW, Hsu JL, ฮุง MC กลไกควบคุมการแสดงออกของ PD-L1 ในมะเร็ง โมล เซลล์. 2019;76:359–70.
24. เบิร์ค เจดี หนุ่ม HA IFN- : ไซโตไคน์ในเวลาที่เหมาะสมอยู่ในตำแหน่งที่ถูกต้อง เซมิน อิมมูนอล. 2019;43:101280.
25. เชนา จี, แคปแลน เอ็มเจ ทุกสิ่งที่คุณอยากรู้มาโดยตลอดเกี่ยวกับ 3-AR* (* แต่ไม่กล้าถาม) เซลล์. 2019;8:357.
26. Liu Y, Guo YL, Zhou SJ, Liu F, Du FJ, เจิ้ง XJ และคณะ CREB เป็นตัวควบคุมการถอดรหัสเชิงบวกของแกมมาอินเตอร์เฟอรอนในการติดเชื้อวัณโรคที่แฝงอยู่แต่ไม่แสดงฤทธิ์ คลินิกแอดวัคซีนอิมมูนอล 2010;17:1377–80.
27. แซมเทน บี, ทาวน์เซนด์ เจซี, ไวส์ เอสอี, บูมิก เอ, คลูคาร์ พี, แชมส์ เอช และคณะ ปัจจัยการถอดรหัส CREB, ATF และ AP-1 ควบคุมการหลั่ง IFN-แกมมาโดยทีเซลล์ของมนุษย์เพื่อตอบสนองต่อแอนติเจนของมัยโคแบคทีเรีย เจ อิมมูนอล. 2008;181:2056–64.
28. Matloubian M, Lo CG, Cinamon G, Lesneski MJ, Xu Y, Brinkmann V, และคณะ เม็ดเลือดขาวลิมโฟไซต์ออกจากต่อมไทมัสและอวัยวะต่อมน้ำเหลืองส่วนปลายขึ้นอยู่กับตัวรับ S1P 1 ธรรมชาติ 2004;427:355–60.
29. Li MH, Hla T, Ferrer F. FTY720 ยับยั้งการเจริญเติบโตของเนื้องอก และเพิ่มผลการยับยั้งเนื้องอกของโทโพทีแคนในนิวโรบลาสโตมา โดยการรบกวนเส้นทางการส่งสัญญาณสฟิงโกลิพิด มะเร็งเลือดในเด็ก 2013;60:1418–23.
30. ชิสโฮล์ม KM, ฉาง กิโลวัตต์, เจือง มอนแทนา, กว็อก เอส, เวสต์ RB, ฮีเรมา-แม็คเคนนีย์ เออี การแสดงออกของตัวรับ beta-adrenergic ในเนื้องอกในหลอดเลือด มด พาธอล. 2012;25:1446–51.
31. มอนโตยา เอ, อมายา CN, เบลมอนต์ เอ, Diab N, Trevino R, Villanueva G, และคณะ การใช้ beta-blockers แบบไม่คัดเลือกสัมพันธ์กับดัชนีการแพร่กระจายของเนื้องอกที่ลดลงในมะเร็งเต้านมระยะเริ่มแรก Oncotarget. 2017;8:6446–60.
32. เรนส์ SL, อมายา CN, ไบรอัน บีเอ ตัวรับเบต้า - อะดรีเนอร์จิกแสดงออกในมะเร็งหลายชนิด มะเร็งวิทยา 2017;4:95–105.
33. Verly IR, รถตู้ Kuilenburg ABP, Abeling NGGM, Goorden SMI, Fiocco M, Vaz FM, และคณะ โปรไฟล์ Catecholamines ในการวินิจฉัย: เพิ่มความไวในการวินิจฉัยและความสัมพันธ์กับลักษณะทางชีววิทยาและทางคลินิกในผู้ป่วย neuroblastoma ยูโร เจ แคนเซอร์. 2017;72:235–43.
34. Eng JWL, Kokolus KM, Reed CB, Hylander BL, MA WW, Repasky, และคณะ สภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกในระบบประสาท: ผลกระทบของความเครียดอะดรีเนอร์จิกต่อเซลล์มะเร็ง การกดภูมิคุ้มกัน และการตอบสนองของภูมิคุ้มกันบำบัด มะเร็ง อิมมูนอล อิมมูโนเทอร์ 2014;63:1115–28.
35. ดาบาฮาร์ เอฟเอส, แม็คอีเวน บีเอส. ความเครียดเฉียบพลันจะเพิ่มขึ้น ในขณะที่ความเครียดเรื้อรังไปกดภูมิคุ้มกันที่เกิดจากเซลล์ ในร่างกาย: บทบาทที่เป็นไปได้สำหรับการค้าเม็ดเลือดขาว ภูมิคุ้มกันพฤติกรรมสมอง 1997;11:286–306.
36. ดาบฮาร์ เอฟเอส. การเพิ่มการทำงานของระบบภูมิคุ้มกันที่เกิดจากความเครียด - บทบาทของฮอร์โมนความเครียด การค้าเม็ดเลือดขาว และไซโตไคน์ ภูมิคุ้มกันพฤติกรรมสมอง 2002;16:785–98.
37. เฉียว จี, เฉิน เอ็ม, บัคเซก เอ็มเจ, รีปาสกี้ อีเอ, ไฮแลนเดอร์ บีแอล. การส่งสัญญาณอะดรีเนอร์จิค: จุดตรวจที่เป็นเป้าหมายซึ่งจำกัดการพัฒนาการตอบสนองของภูมิคุ้มกันต้านมะเร็ง อิมมูนอลด้านหน้า 2018;9:164.
38. Rigo V, Emionite L, Daga A, Astigiano S, Corrias MV, Quintarelli C, และคณะ การบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันแบบผสมผสานกับแอนติ-PDL-1/PD-1 และแอนติ-CD4 แอนติบอดีจะรักษานิวโรบลาสโตมาที่แพร่กระจายแบบซินจีนิก ตัวแทนวิทยาศาสตร์ 2017;7:14049.
39. Majzner RG, Simon JS, Grosso JF, Martinez D, Pawel BR, Santi M, และคณะ การประเมินการแสดงออกของเดธลิแกนด์ 1 ที่ตั้งโปรแกรมไว้และเซลล์ภูมิคุ้มกันที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกในเนื้อเยื่อมะเร็งในเด็ก มะเร็ง. 2017;123:3807–15.
40. Gibbons Johnson RM, Dong H. การแสดงออกเชิงหน้าที่ของลิแกนด์ความตายที่ตั้งโปรแกรมไว้ 1 (B7-H1) โดยเซลล์ภูมิคุ้มกันและเซลล์เนื้องอก อิมมูนอลด้านหน้า 2017;8:961.
41. Peng Q, Qiu X, Zhang Z, Zhang S, Zhang Y, Liang Y และคณะ PD-L1 บนเซลล์เดนไดรต์ทำให้การกระตุ้นทีเซลล์อ่อนฤทธิ์และควบคุมการตอบสนองต่อการปิดกั้นจุดตรวจภูมิคุ้มกัน แนทคอม. 2020;11:4835.
42. Singhal S, Stadanlick J, Annunziata MJ, Rao AS, Bhojnagarwala PS, O'Brien S, และคณะ โมโนไซต์/มาโครฟาจที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกในมนุษย์ และการควบคุมการตอบสนองของทีเซลล์ในมะเร็งปอดระยะเริ่มแรก วิทย์แปลเมด 2019;11:อีท1500.
43. Blackburn SD, Shin H, Haining WN, Zou T, Workman CJ, Polley A, และคณะ การควบคุมแกนของ CD8+ การอ่อนแรงของทีเซลล์โดยตัวรับที่ยับยั้งหลายตัวในระหว่างการติดเชื้อไวรัสเรื้อรัง แนท อิมมูนอล. 2009;10:29–37.
44. จิน HT, แอนเดอร์สัน เอซี, ตัน WG, เวสต์ EE, ฮา เอสเจ, อารากิ เค และคณะ ความร่วมมือของ Tim-3 และ PD-1 ในการหมดแรงของ CD8 T-cell ในระหว่างการติดเชื้อไวรัสเรื้อรัง Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 2010;107:14733–8.
45. ซากุอิชิ เค, อาเปโตห์ แอล, ซัลลิแวน เจเอ็ม, บลาซาร์ บีอาร์, คูโคร วีเค, แอนเดอร์สัน เอซี การกำหนดเป้าหมายวิถี Tim-3 และ PD-1 เพื่อฟื้นฟูความอ่อนล้าของทีเซลล์และฟื้นฟูภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอก เจเอ็กซ์พีเมด 2010;207:2187–94.
46. อากาตะ วาย, คาวาซากิ เอ, นิชิมูระ เอช, อิชิดะ วาย, สึบาตะ ที, ยากิตะ เอช และอื่นๆ การแสดงออกของแอนติเจน PD-1 บนพื้นผิวของทีและบีลิมโฟไซต์ของหนูเมาส์ที่ถูกกระตุ้น อินท์ อิมมูนอล. 1996;8:765–72.
47. วิภาการ์ ร., ฮวน จี, ตรากานอส เอฟ, ดาร์ซินคีวิซ แซด, ฟิงเกอร์ LR การแสดงออกที่เกิดจากการกระตุ้นของยีน-1 การเสียชีวิตที่ตั้งโปรแกรมไว้ของมนุษย์ในที-ลิมโฟไซต์ ประสบการณ์เซลล์ Res 1997;232:25–8.
48. ฟรีแมน GJ, ลอง AJ, Iwai Y, Bourque K, Chernova T, Nishimura H, และคณะ การมีส่วนร่วมของรีเซพเตอร์ที่ยับยั้งภูมิคุ้มกันของ PD-1 โดยสมาชิกแฟมิลี B7 ชนิดใหม่ทำให้เกิดการควบคุมเชิงลบของการกระตุ้นลิมโฟไซต์ เจเอ็กซ์พีเมด 2000;192:1027–34.
49. Gros A, Robbins PF, Yao X, Li YF, Turcotte S, Tran E, และคณะ PD-1 ระบุส่วน CD8(+) ที่ทำปฏิกิริยากับเนื้องอกซึ่งจำเพาะต่อคนไข้ซึ่งแทรกซึมเข้าไปในเนื้องอกของมนุษย์ เจคลินลงทุน 2014;124:2246–59.
50. Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F, Kirilovsky A, Mlecnik B, Lagorce-Pagès C, และคณะ ชนิด ความหนาแน่น และตำแหน่งของเซลล์ภูมิคุ้มกันภายในเนื้องอกในลำไส้ใหญ่ของมนุษย์ทำนายผลลัพธ์ทางคลินิก ศาสตร์. 2006;313:1960–4.
51. มินา เอ็ม, โบลดรินี อาร์, ซิตติ เอ, โรมาเนีย พี, ดาลิกันโดร วี, เด อิโอริส เอ็ม, และคณะ T lymphocytes ที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอกช่วยปรับปรุงผลลัพธ์ทางคลินิกของ neuroblastoma ที่ดื้อต่อการรักษา มะเร็งวิทยา. 2015;4:e1019981.
52. เมไลอู โอ, คิเอริซี เอ็ม, ลูการินี วี, เจอร์แมน จี, คอนติ แอลเอ, เด วิโต อาร์ และคณะ ลายเซ็นของเซลล์และยีนของเซลล์เดนไดรต์ที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอกและเซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติทำนายการพยากรณ์โรคของนิวโรบลาสโตมา แนทคอม. 2020;11:5992.
53 Jorgovanovic D, Song M, Wang L, Zhang Y. บทบาทของ IFN-gamma ในการลุกลามและการถดถอยของเนื้องอก: การทบทวน ไบโอมาร์ค เรส 2020;8:49.
54. Zhang J. Yin และ Yang มีอิทธิพลซึ่งกันและกันของ IFN-gamma ในการอักเสบและโรคภูมิต้านตนเอง เจคลินลงทุน 2007;117:871–3.
55. โอเคเค เค, อองเช่ร์ เอส, บูวิเยร์ เอ็ม, มิเชล เอ็มซี การลดความไวของตัวรับเบต้า3 -ที่เกิดจากอะโกนิสต์: ที่ไหน เมื่อไหร่ และอย่างไร พี่เจ ฟาร์มา. 2019;176:2539–58.
56. Castriconi R, Dondero A, Augugliaro R, Cantoni C, Carnemolla B, Sementa AR, และคณะ การจำแนก 4Ig-B7-H3 เป็นโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับนิวโรบลาสโตมาซึ่งมีบทบาทในการป้องกันจากการสลายที่มีเซลล์เป็นสื่อกลาง NK Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 2004;101:12640–5.
